劉愛(ài)文，陳曉剛，陳 忻，卜海東

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院理學(xué)院，廣東 佛山 528000)

酶法提取芝麻中的短肽

劉愛(ài)文，陳曉剛，陳 忻，卜海東

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院理學(xué)院，廣東 佛山 528000)

以黑芝麻為原料，用乙酸乙酯、異丙醇、石油醚3種溶劑脫脂，再用堿提酸沉法提取出芝麻蛋白；利用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解制備短肽，以水解度為考察指標(biāo)優(yōu)選出最佳單酶，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化并確定最佳水解條件。結(jié)果表明：乙酸乙酯脫脂效果最好，其脫脂率達(dá)90.22%；堿性蛋白酶為最佳單酶；在底物質(zhì)量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質(zhì)量比(E/S)3.0%、酶解時(shí)間4.0h時(shí)水解度為24.10%，總氮回收率為78.28%，所制得短肽的平均肽鏈長(zhǎng)度為2.93。

黑芝麻；脫脂；芝麻蛋白；酶解

Abstract：Black sesame seeds were degreased using several degreasing agents including ethyl acetate, isopropanol and petroleum ether. Sesame protein was extracted by alkali extraction and acid precipitation. The optimal single enzyme was selected by the degree of hydrolysis. The hydrolysis conditions were optimized through orthogonal experiments. Results indicated that ethyl acetate was the most effective degreasing agent with a degreasing rate of 90.22%. Alkali protease was the optimal enzyme for the hydrolysis of sesame protein. The optimal hydrolysis conditions were substrate concentration of 1.0 g/100mL, hydrolysis temperature of 40.0 ℃, hydrolysis pH of 9.0, enzyme-concentration (E/S) ratio of 3.0%, and enzymatic hydrolysis time of 4.0 h. The degree of hydrolysis of sesame protein reached up to 24.10% and the recovery rate of total nitrogen was 78.28% under the optimal hydrolysis conditions. The average length of prepared small peptides was 2.93.

Key words：black sesame；extraction；sesame protein；enzymatic hydrolysis

近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)生物活性肽進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，已有多肽藥物和營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品推向市場(chǎng)，市場(chǎng)前景極為可觀[1]。研究表明：活性肽都以非活性狀態(tài)存在于蛋白質(zhì)長(zhǎng)鏈中，當(dāng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄋ獾玫竭@些低肽時(shí)，其活性就釋放出來(lái)[2]；許多活性肽具有原蛋白質(zhì)或其組成氨基酸所沒(méi)有的功能，它們與機(jī)體各種功能調(diào)節(jié)、疾病的發(fā)生及免疫、內(nèi)分泌、衰老、代謝等有著非常密切的關(guān)系，在生命活動(dòng)中起著非常重要的作用[3]。目前，我國(guó)在這方面雖已有可喜的發(fā)展，但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，尚有一定的差距，因此，生物活性肽的研究在我國(guó)具有較為廣泛的前景[4]。

芝麻自古以來(lái)就是我國(guó)人人皆知的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品。據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，芝麻含有豐富的VA、VD、VE和優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)；不飽和脂肪酸、卵磷脂、谷氨酸含量很高，是天然的調(diào)味香料。芝麻具有烏須發(fā)、宜脾胃、補(bǔ)肝腎、生精益髓、潤(rùn)腸通便、促進(jìn)血液循環(huán)、益智健腦等功能。但是與其他作物相比，其還未得到充分開發(fā)利用[1,3]。

芝麻屬胡麻科(Pedaliaceae)胡麻屬(Sesamum indicumL.)，是我國(guó)四大油料之一，2000年我國(guó)芝麻產(chǎn)量已達(dá)81萬(wàn)t[5]。芝麻中的蛋白質(zhì)含量為20%～22%，芝麻蛋白質(zhì)氨基酸組成與牛肉相比，除賴氨酸含量較低外，其余皆接近或達(dá)到FAO/WHO建議優(yōu)質(zhì)蛋白，且富含硫氨基酸，尤其蛋氨酸含量高于其他植物蛋白[1,3]?？勺鳛榈鞍踪|(zhì)和含硫氨基酸強(qiáng)化劑，以彌補(bǔ)大豆蛋白的不足。大量研究證實(shí)蛋白質(zhì)在人體內(nèi)并不是全部以單個(gè)氨基酸形式被吸收，而是以小肽、寡肽的形式被人體吸收，且這種小肽、寡肽被吸收的效果要比氨基酸好，同時(shí)這些小肽、寡肽還都具有特殊的生物活性功能。我國(guó)近幾年也開始對(duì)植物活性肽的提取和研究，一般是對(duì)大豆、豌豆、玉米等研究報(bào)道較多，但對(duì)芝麻肽的制備和研究報(bào)道還是比較少的。本實(shí)驗(yàn)研究用酶解法制備芝麻活性肽，旨在為芝麻活性肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑芝麻 市購(gòu)。生物酶制劑：堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g)、木瓜蛋白酶(80萬(wàn)U/g)、菠蘿蛋白酶(20萬(wàn)U/g) 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；79-1型控溫磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠；800型離心沉淀器上海手術(shù)器械廠；KDN-2C 型定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；FA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ-82A恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；WH95-1多功能攪拌機(jī) 順德市白馬電器塑料廠；CS101-2E型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海訊能電熱設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 芝麻脫脂

1.2.1.1 脫脂方法[6]

稱取芝麻10.00g三份，粉碎，分別用異丙醇、乙酸乙酯、石油醚浸泡，用磁力攪拌器攪拌，每30min攪拌1次，每次攪拌5min。浸泡2h，浸泡結(jié)束后傾去上清液，然后用蒸餾水把脫脂芝麻洗3遍，置于烘箱中烘干。取出一定量的脫脂芝麻，用索氏提取器繼續(xù)脫脂，稱取處理前后的質(zhì)量，計(jì)算芝麻中剩余脂肪量，比較異丙醇、乙酸乙酯、石油醚的脫脂效果。選擇脫脂率最高的有機(jī)溶劑。

1.2.1.2 芝麻脂肪的測(cè)定[7]

采用快速抽提法測(cè)定芝麻脂肪含量。樣品用乙醚回流提取，使樣品中的脂肪進(jìn)入溶劑中，回收溶劑后所得到的殘留物，即為粗脂肪。稱取一定量樣品于蒸發(fā)皿中，加入海砂20g，于沸水浴上蒸干后，再于95～105℃烘干、研細(xì)，全部移入濾紙筒內(nèi)，蒸發(fā)皿及有樣品的玻璃棒都用沾有乙醚的脫脂棉擦凈，將棉花一同放進(jìn)濾紙筒內(nèi)。濾紙筒放入索氏抽提器內(nèi)，連接已干燥至恒質(zhì)量的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入無(wú)水乙醚，加至接受瓶2/3體積處，于水浴上加熱(65℃)使乙醚不斷的回流提取，至抽提完全為止。

計(jì)算方法：

式中：m1為未脫脂的粗脂肪質(zhì)量/g；m2為脫脂后的粗脂肪質(zhì)量/g。

1.2.2 提取芝麻蛋白的方法[8-9]

芝麻蛋白主要是堿溶性蛋白，在堿性條件下溶解度較大，所以提取基本方法是堿提酸沉法。稱取200.0g脫脂芝麻，加水[料液比為1:10(g/mL)]，攪拌均勻。加入一定量的0.5% NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至10.0，控制溫度在50℃，緩慢攪拌，使蛋白質(zhì)在堿性狀態(tài)下溶解，一般溶解時(shí)間為4h，離心分離，得到蛋白液。取上述蛋白液調(diào)節(jié)pH值至芝麻蛋白的等電點(diǎn)(pH4.5左右)，靜置，沉淀，干燥得到芝麻分離蛋白。

1.2.3 酶解芝麻蛋白制備活性肽的工藝流程[10-11]

芝麻蛋白→預(yù)處理→保溫酶解→滅酶→冷卻→離心→芝麻蛋白水解液

1.2.3.1 芝麻蛋白酶解前的預(yù)處理[12]

稱取1.0g芝麻蛋白若干份，加入一定比例的水勻漿，調(diào)節(jié)適宜pH值，于恒溫水浴鍋中加熱至預(yù)設(shè)定的酶解溫度。

1.2.3.2 酶解處理[13]

待芝麻蛋白水溶液的溫度達(dá)到預(yù)設(shè)值時(shí)，加入定量的酶，置于確定溫度的恒溫水浴鍋內(nèi)計(jì)時(shí)進(jìn)行酶解。整個(gè)酶解過(guò)程中，需不停攪拌以保證反應(yīng)充分。

1.2.3.3 滅酶處理

酶解結(jié)束后，水解液立即置于沸水浴中10min加熱滅酶，冷卻反應(yīng)液于4000r/min離心10min得到芝麻蛋白水解液，測(cè)量水解上清液體積，然后冷藏保存。

1.2.4 芝麻蛋白總氮含量的測(cè)定

[14]、[15]，用半微量凱氏定氮法測(cè)定芝麻蛋白總氮含量。

1.2.5 水解液水解度、總氮回收率、平均肽鏈長(zhǎng)度的測(cè)定

1.2.5.1 蛋白質(zhì)水解物中的氮含量測(cè)定

采用半微量凱氏定氮法。取水解上清液10.0mL，放入定氮管中，加入硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、加熱消化至淡藍(lán)色，液體澄清，冷卻定容到100mL，用半微量凱氏定氮法定氮。

1.2.5.2 酶解液中游離氨態(tài)氮測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]，采用電位滴定法測(cè)定游離氨態(tài)氮含量。

1.2.5.3 水解液水解度、總氮回收率、平均肽鏈長(zhǎng)度的計(jì)算公式

式中：L為平均肽鏈長(zhǎng)度；m為蛋白質(zhì)水解物中的氮含量/%；n為酶解液中游離氨態(tài)氮/%。

1.2.6 酶的篩選

將1.0g芝麻蛋白用水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的溶液，按酶與底物質(zhì)量比為2%加入堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶，按擬定各酶的適宜溫度、pH值水解4h后測(cè)定水解度。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種脫脂劑脫脂效果的比較

芝麻中脂肪的含量很高，如果酶解產(chǎn)物含有較多的脂肪會(huì)造成其在溫度較高時(shí)容易焦化，而且對(duì)氮含量的測(cè)定結(jié)果有一定的影響。因此，先將芝麻脫脂以供下一步提取蛋白。比較3種脫脂劑對(duì)芝麻脫脂率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 脫脂劑的萃取水浴溫度Table 1 Extraction temperature of different degreasing agents

表2 脫脂前后芝麻脫脂率比較Table 2 Comparison on degreasing rates of different degreasing agents

由表2可見(jiàn)，乙酸乙酯的脫脂效果最好，脫脂率達(dá)90.22%；其次是異丙醇脫脂，脫脂率為71.78%；石油醚脫脂率僅為70.44%。因此選用脫脂效果最好的乙酸乙酯為脫脂劑。

2.2 芝麻蛋白的提取

按1.2.2節(jié)方法，稱取脫脂芝麻200.0g，用堿提酸沉法制備出芝麻蛋白40.3g，顏色為褐色，有醇香味道。

2.3 總氮含量的測(cè)定

用半微量凱氏定氮法。兩次滴定分別消耗0.025mol/L硫酸14.30mL和14.70mL，空白實(shí)驗(yàn)消耗硫酸0.20mL。計(jì)算得芝麻蛋白總氮含量為9.21%，總蛋白質(zhì)含量48.81%。

2.4 酶的篩選

按1.2.6節(jié)方法對(duì)所選擇的酶進(jìn)行篩選，所得結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白的水解度較大，這是因?yàn)橹ヂ榈鞍自趬A性溶液中的溶解性較大，從而酶能充分地和蛋白接觸進(jìn)行水解。因此選擇堿性蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。

表3 不同蛋白酶水解芝麻蛋白的水解度結(jié)果Table 3 Degrees of hydrolysis for sesame protein digested by different proteases

2.5 最佳酶解條件的確定

2.5.1 堿性蛋白酶酶解芝麻蛋白酶解條件的正交試驗(yàn)

表4 堿性蛋白酶水解芝麻蛋白正交試驗(yàn)因素水平表Table 4 Factors and levels of sesame protein digested by alkali protease

表5 堿性蛋白酶水解芝麻蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiments for the digestion of sesame protein using alkali protease

本研究選A(溫度)/℃、B(酶解時(shí)間)/h、C(pH值)、D(酶與底物質(zhì)量比)/%、E底物質(zhì)量濃度/(g/100mL)這5個(gè)因素，各取5個(gè)水平，以水解度為考察指標(biāo)，按表4因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5極差(R)的結(jié)果可以看出：各因素對(duì)芝麻蛋白水解度影響的主次順序?yàn)镋＞A＞C＞D＞B，即對(duì)水解度影響的主次因素為底物質(zhì)量濃度＞溫度＞pH值＞酶與底物質(zhì)量比＞酶解時(shí)間。根據(jù)水平均值(k)可以得出最優(yōu)水平組為A1B3C4D5E1，即底物質(zhì)量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質(zhì)量比3.0%、酶解時(shí)間4.0h，在此條件下酶解芝麻蛋白其水解度可達(dá)24.10%。

2.5.2 各條件下的總氮回收率、平均肽鏈長(zhǎng)度

按照式(3)、(4)計(jì)算總氮回收率和平均肽鏈長(zhǎng)度，所得結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 堿性蛋白酶在各條件下水解芝麻蛋白總氮回收率和平均肽鏈長(zhǎng)度Table 6 Recovery rate of total nitrogen and the average length of small peptides prepared by sesame protein digestion using alkali protease at different conditions

由表6可知，實(shí)驗(yàn)測(cè)得產(chǎn)品中總氮回收率在34.26%～97.83%，平均肽鏈長(zhǎng)度2.36～19.75。若在表5得出的最優(yōu)水平組A1B3C4D5E1，即底物質(zhì)量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質(zhì)量比3.0%、酶解時(shí)間4.0h的條件下，酶解芝麻蛋白其總氮回收率為78.28%。所制得短肽的平均肽鏈長(zhǎng)度為2.93。

3 結(jié) 論

用實(shí)驗(yàn)方法比較3種有機(jī)溶劑對(duì)芝麻的脫脂效果，其中乙酸乙酯脫脂效果最好，并比較3種蛋白酶水解芝麻蛋白的效果，確定堿性蛋白酶為最佳單酶，其最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度1.0g/100mL、溫度40.0℃、pH9.0、酶與底物質(zhì)量比3.0%、酶解時(shí)間4.0h，此時(shí)水解度最好為24.10%，總氮回收率為78.28%。所制的短肽的平均肽鏈長(zhǎng)度為2.93。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李睜明, 王蘭君. 植物蛋白生產(chǎn)工藝與配方[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1998:35-50.

[2] YOSHIKAWA M, FUJITA H, MATOBA N, et al. Bioactive peptides derived from food proteins preventing lifestyle-related diseases[J]. Bio Factors, 2000, 12:143-146.

[3] 陳璦, 周玫. 自由基醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與病理生理[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002, 10(8):21-23.

[4] 周永治. 生物活性肽的種類及應(yīng)用[J]. 江蘇調(diào)味副食品, 2007, 24(6):14-15.

[5] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 中國(guó)農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料(2000)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2001:70-80.

[6] 王雅卿, 郭恒斌, 曾慶祝. 鯉魚脫脂方法的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2006:297-300.

[7] 林麗云. 生物酶法制備波紋巴非蛤小分子肽及其脫色脫苦脫腥研究[D]. 廣州:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所, 2004.

[8] 金青哲. 芝麻蛋白提取工藝研究[J]. 糧食與油脂, 1999(3):19-21.

[9] 李干紅, 丁曉雯. 芝麻蛋白酶解條件控制及其產(chǎn)物抗氧化研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2006, 21(1):104-108.

[10] 陳義勇, 王偉, 沈宗根, 等. 芝麻蛋白水解工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(9):17-20.

[11] 李鳳霞, 陳乃強(qiáng), 張鐘. 芝麻肽最適酶類的選擇與水解條件的確定[J]. 糧油食品科技, 2007, 5(2):50-51.

[12] ALOBO A P. Effect of sesame seed flour on millet biscuit characteristics[J]. Plant Foods for Human Nutrition (Formerly Qualitas Plantarum),2001, 56(2):195-202.

[13] 吳疆, 童應(yīng)凱, 金紅, 等. 堿性蛋白酶水解玉米蛋白的研究[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2007(2):26-27.

[14] 張玉葵, 葉爾太. 凱氏定氮(半微量)法測(cè)定牛乳中蛋白質(zhì)含量的方法[J]. 乳品加工, 1998(3):36-39.

[15] 寧正祥. 食品成分分析手冊(cè)[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社, 1998:117-121.

[16] 謝偉斌, 陳錦成, 林铓鏵, 等. 酶解低值蝦蛋白制取功能多肽飲料的工藝技術(shù)研究[J]. 食品科技, 2007, 32(2):202-205.

Extraction of Small Peptides from Sesame by Enzymatic Hydrolysis

LIU Ai-wen，CHEN Xiao-gang，CHEN Xin，BU Hai-dong
(Science School, Foshan University, Foshan 528000, China)

TQ936.16

A

1002-6630(2010)22-0145-04

2010-07-08

劉愛(ài)文(1956—)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，主要從事無(wú)機(jī)化學(xué)及其相關(guān)領(lǐng)域研究。E-mail：annieliuaw@hotmail.com