陳 諾，唐善虎,*，陳進(jìn)會，岑璐伽，李 雪，龍 虎

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東 東莞 523072)

雙重PCR方法檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌

陳 諾1，唐善虎1,*，陳進(jìn)會2，岑璐伽1，李 雪1，龍 虎1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東 東莞 523072)

為建立能夠同時檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法。采用沙門氏菌鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌馬尿酸酶基因hipO設(shè)計特異性引物，并對影響PCR擴(kuò)增的主要因素——引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度因素進(jìn)行優(yōu)化，比較單一PCR和雙重PCR的檢測效果。結(jié)果表明：采用單一PCR法檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌時，靈敏度分別可達(dá)到3.98pg和4.05pg；而采用雙重PCR檢測時，靈敏度較單一PCR法有所下降，沙門氏菌和空腸彎曲菌檢出限量分別為398pg和40.5pg。本研究建立的特異性強(qiáng)和靈敏度高的雙重PCR檢測方法，可為實現(xiàn)食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的同時檢測提供新方法。

沙門氏菌；空腸彎曲菌；雙重PCR；檢測

Abstract：A rapid assay for simultaneous detection ofSalmonella sppandCampylobacter jejuniin food was developed. The primers were designed based on thefimYgene ofSalmonellaspp andhipOgene ofCampylobacter jejuni. Annealing temperatures,Mg2+concentrations, and primer concentrations were optimized. The detection limit was 3.98 pg forSalmonellaspp and 4.05 pg forCampylobacter jejuniusing the single PCR method. However, the detection limit of the duplex PCR method was significantly higher, which was 398 pg, 40.5 pg forSalmonellaspp andCampylobacter jejuni, respectively. In this study, a duplex PCR with high specificity and sensitivity was developed and it would provide useful information for the simultaneous detection ofSalmonellaspp andCampylobacter jejuniin food.

Key words：Salmonellaspp；Campylobacter jejuni；Duplex PCR；Detection

沙門氏菌和空腸彎曲菌是常見的重要食源性致病菌，常污染肉、乳和禽等動物性食品。污染的食品引起腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重的可引起死亡[1]。此外，空腸彎曲菌的感染與人的格林-巴氏綜合癥等具有自身免疫特性的疾病有關(guān)[2]。

對這兩種致病菌的檢測通常采取傳統(tǒng)的方法，先選擇性增菌，然后作生化試驗和血清學(xué)鑒定，大約需要3～14d獲得檢測結(jié)果。由于沙門氏菌血清型繁多、污染食品時數(shù)量少，并且易受食品成分及食品深加工等影響，若采用常規(guī)方法檢測沙門氏菌難度較大，容易出現(xiàn)錯檢和漏檢。而對空腸彎曲菌的檢測方法，普遍采用快速馬尿酸酶試驗[3]。由于空腸彎曲菌分類復(fù)雜、生長條件苛刻、生化檢測不可靠，傳統(tǒng)方法都存在著不同程度的假陰性率、假陽性率現(xiàn)象[4]。采用多重PCR技術(shù)可以很好地解決這些問題，多重PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便和成本低等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測。在沙門氏菌檢測時，采用的靶點主要有invA、fimA、stn、hilA等基因[5]，而空腸彎曲菌檢測的基因主要有mapA、hipO和ceuE等基因[3]，并且大多數(shù)研究主要針對單個菌進(jìn)行的，尚未見使用雙重PCR同時檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌的研究報道。因此，本研究以沙門氏菌保守的鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌馬尿酸酶基因hipO為目的基因設(shè)計特異性引物，建立同時能夠檢測出沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法，并通過優(yōu)化雙重PCR的條件提高雙重PCR檢測的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

沙門氏菌C79-13、46株沙門氏菌初步分離菌株、空腸彎曲菌ATCC33560、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922由本實驗室保存，沙門氏菌、志賀氏菌由本實驗室分離保存，單核細(xì)胞增生性李斯特菌由東莞出入境檢驗檢疫局惠贈。沙門氏菌、空腸彎曲菌培養(yǎng)基配制及增菌參考國標(biāo)GB/T 4789.4—2008[6]和GB/T 4789.9—2008[7]，其余菌株均接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h備用。

TaqDNA聚合酶(5U/μL)、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2(25mmol/L)、dNTP Mixture(各 2.5mmol/L)、100bp DNA ladder Marker 大連寶生物工程有限公司；GOLD-VIEWTM染料和瓊脂糖 上海賽百盛基因技術(shù)有限公司。

PCR擴(kuò)增儀 Eppendorf公司；核酸蛋白檢測儀Beckman公司；改良Skirrow氏瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基 杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制備

取沙門氏菌LB增菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，取10-4～10-7四個稀釋度菌液涂板，37℃培養(yǎng)24h后平板計數(shù)，計數(shù)原始菌液濃度。取空腸彎曲菌布氏肉湯培養(yǎng)液，稀釋同沙門氏菌稀釋，涂改良Skirrow氏血平板，42℃微需氧條件下培養(yǎng)24h后，進(jìn)行菌落計數(shù)。原始菌液中沙門氏菌濃度為1.27×107CFU/mL、空腸彎曲菌濃度為2.12×106CFU/mL。參考黃金林等[8]報道的方法提取細(xì)菌基因組D NA，并利用核酸蛋白測定儀測定沙門氏菌DNA質(zhì)量濃度為39.81μg/mL、空腸彎曲菌的質(zhì)量濃度為 40.50μg/mL。

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)沙門氏菌fimY基因、空腸彎曲菌hipO基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物Table 1 Primer sequences and amplified products

1.2.3 單基因PCR擴(kuò)增及特異性分析

對沙門氏菌C79-13、空腸彎曲菌ATCC33560菌株的基因組DNA分別進(jìn)行單基因擴(kuò)增。擴(kuò)增體系[9]為：10×PCR Buffer 2.5μL、Mg2+1.5mmol/L、dNTP Mixture 200μmol/L，上下游引物各0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、模板DNA 1μL，加滅菌去離子水至25μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s共35個循環(huán)，最后72℃ 5min。取6μL PCR產(chǎn)物經(jīng)GOLD-VIEWTM染色，于100V電壓下進(jìn)行30g/L瓊脂糖凝膠電泳40min檢測。

1.2.4 雙重PCR擴(kuò)增體系

擴(kuò)增體系為：10×PCR Buffer 2.5μL、Mg2+1.5mmol/L、dNTP Mixture 200μmol/L，兩對上下游引物各0.4μmol/L、TaqDNA聚合酶1U、兩種模板DNA各1μL，加滅菌去離子水補(bǔ)齊25μL，擴(kuò)增條件同1.2.3節(jié)。

1.2.5 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化

分別對影響PCR擴(kuò)增的主要條件引物濃度、退火溫度、Mg2+濃度。確定最佳PCR反應(yīng)體系。

1.2.6 雙重PCR特異性與靈敏度分析

取沙門氏菌、空腸彎曲菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、用優(yōu)化好的雙重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將已經(jīng)測定濃度的沙門氏菌、空腸彎曲菌DNA模板分別作100～10-7梯度稀釋，取不同稀釋度的模板進(jìn)行單基因PCR擴(kuò)增，取相同稀釋度的不同模板混合，對不同梯度混合模板用優(yōu)化好的擴(kuò)增條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 單基因PCR特異性分析

采用沙門氏菌鞭毛基因fimY和空腸彎曲菌基因hipO設(shè)計引物，通過在線BLAST程序[10-11]驗證兩對引物特異性。用設(shè)計的引物分別對沙門氏菌、空腸彎曲菌進(jìn)行單基因PCR擴(kuò)增，以46株沙門氏菌分離株與常見食源性致病菌單核細(xì)胞增生性李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸桿菌等為供試菌株做特異性試驗。結(jié)果顯示46株沙門氏菌均出現(xiàn)423bp擴(kuò)增條帶，其它菌株均無特異性擴(kuò)增條帶。

2.2 雙重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

將兩種DNA模板混合，分別使用不同濃度的單對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定一個合適的引物濃度范圍，再采用不同引物濃度組合進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)合擴(kuò)增效果和引物用量，確定最佳引物濃度組合為沙門氏菌0.6μmol/L和空腸彎曲菌為0.4μmol/L，結(jié)果見圖1。按退火溫度一般低于Tm值3～5℃優(yōu)化原則[12]，選擇46.2、47.1、48.4、50.1、52、53.1、55.8、57.6、59、60、60.8℃ 11個不同溫度進(jìn)行多重PCR退火溫度優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50.1～59℃間退火溫度的條帶最為理想，考慮到退火溫度較高可能降低擴(kuò)增效率，取52℃作為退火溫度，結(jié)果見圖2。在其他最佳條件下，選擇Mg2+濃度為0.5～3.0mmol/L，以0.5mmol/L為梯度調(diào)整Mg2+濃度，根據(jù)結(jié)果，再在1.0～3.0mmol/L之間，以0.2mmol/L為梯度調(diào)整Mg2+濃度，確定最佳Mg2+濃度為2.0mmol/L，結(jié)果見圖3。

圖1 雙重PCR不同引物濃度組合電泳圖Fig.1 Various primer concentrations and electrophoretic bands from duplex PCR

圖2 雙重PCR不同退火溫度電泳圖Fig.2 Various annealing temperatures and electrophoretic bands from duplex PCR

圖3 雙重PCR不同Mg2+濃度電泳圖Fig.3 Various Mg2+concentrations and electrophoretic bands from duplex PCR

2.3 雙重PCR特異性與敏感性分析

單一PCR和雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。單一PCR只出現(xiàn)單一目的條帶，混合模板PCR出現(xiàn)兩條目的條帶，片段大小與設(shè)計相符，擴(kuò)增結(jié)果均無非特異性擴(kuò)增與引物二聚體出現(xiàn)。單一PCR擴(kuò)增沙門氏菌靈敏度可以達(dá)到3.98pg，空腸彎曲菌的靈敏度可達(dá)到4.05pg。比較單一PCR擴(kuò)增結(jié)果與雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5～7)，表明雙重PCR擴(kuò)增靈敏度較單一PCR擴(kuò)增低。在雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果中，沙門氏菌靈敏度降低兩個數(shù)量級，為398pg，空腸彎曲菌減少一個數(shù)量級，為40.5pg。

圖4 雙重PCR特異性結(jié)果Fig.4 Electrophoresis test for the specificity of duplex PCR

圖5 沙門氏菌單基因PCR靈敏度結(jié)果Fig.5 Test for the sensitivity of PCR forSalmonellaspp

圖6 空腸彎曲菌單基因PCR靈敏度結(jié)果Fig.6 Test for the sensitivity ofCampylobacter jejuni

圖7 雙重PCR靈敏度結(jié)果Fig.7 Test for the sensitivity of duplex PCR

3 討 論

隨著食品衛(wèi)生要求的不斷提高，快速檢測食品微生物在食品安全中的重要性愈加明顯。沙門氏菌和空腸彎曲菌是世界范圍內(nèi)食品污染的主要病原菌之一[13]。如何快速檢測食品中沙門氏菌和空腸彎曲菌，縮短檢測時間，提高檢測靈敏度，減少錯檢、漏檢是食品病原微生物檢測的重點。用于沙門氏菌檢測最常見的靶基因有編碼吸附上皮細(xì)胞的蛋白基因invA[14]和腸毒素基因stn[15]等，而常用于空腸彎曲菌檢測靶基因有mapA、ceuE、flaA等[3]。對于單個基因的PCR方法已有較多報道[16-17]，而采用多重PCR對這兩種菌進(jìn)行檢測的報道較少[3,18]。本實驗采用的是高度保守的fimY基因和hipO基因設(shè)計特異性引物，建立了一個快速、同時檢測沙門氏菌和空腸彎曲菌的雙重PCR方法。

實驗中設(shè)計的特異性引物用沙門氏菌和空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)株、46株沙門氏菌分離株以及金黃色葡萄球菌等其余的9株菌進(jìn)行特異性檢測。受試的46株沙門氏菌均能擴(kuò)出目的條帶，而金黃色葡萄球菌等其余的9株菌無特異性擴(kuò)增條帶，說明試驗設(shè)計的引物有較高的種間特異性和屬間特異性。實驗對影響PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度和Mg2+濃度主要因素進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)體系。在本研究中，發(fā)現(xiàn)單一PCR的靈敏度與報道[18]一致，實驗建立的雙重PCR檢測方法檢出沙門氏菌和空腸彎曲菌的靈敏分別達(dá)到398pg和40.5pg，較單一PCR靈敏度低，但比凌霞等[12]報道的三重PCR檢測空腸彎曲菌靈敏度有所提高。在本實驗中導(dǎo)致雙重PCR靈敏度降低的可能原因是各對引物擴(kuò)增時存在對底物以及Taq酶等的競爭，降低了擴(kuò)增產(chǎn)量[19]。本研究基于沙門氏菌fimY基因和空腸彎曲菌的hipO基因建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的雙重PCR檢測方法，該方法在食品沙門氏菌和空腸彎曲菌的檢測中的具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 何國慶, 賈英民. 食品微生物[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002.

[2] Mc CARTHY N, GIESECKE J. Incidence of Guillain Barre Syndrome following infection withCampylobacter jejuni[J]. Am J Epidemiol,2001, 153(6):610-614.

[3] 吳高林, 喬昕, 袁寶君. 空腸彎曲菌多重PCR快速檢測方法建立的研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 34(2):98-99.

[4] STEPHEN L W O, JORDAN P J. Evaluation of 11 PCR assays for species-level identification ofCampylobacter jejuniandCampylobacter coli[J]. Clin Microbiol, 2003, 41:330-336.

[5] 向雪菲, 劉斌, 張利達(dá), 等. 食品中沙門氏菌分子檢測靶點的篩選與評價[J]. 微生物學(xué)報, 2008, 48(7):941-946.

[6] GB/T 4789.4—2008 食品微生物檢驗:沙門氏菌檢驗[S].

[7] GB/T 4789.9—2008 食品微生物檢驗:空腸彎曲菌檢驗[S].

[8] 黃金林, 焦新安, 文其乙, 等. 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測沙門氏菌[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報, 2002, 23(3):5-11.

[9] 魏群. 分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M]. 北京:高等教育出版社, 2005.

[10] NCBI. [EB/OL]. [2010-06-10]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1287639280&job_key=JSID_01_28371_130.14.22.21_9000.

[11] NCBI. [EB/OL]. [2010-06-10]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1287640027&job_key=JSID_01_30069_130.14.24.201_9000&Check+Status=Check.

[12] 凌霞, 沙丹, 肖勇, 等. 空腸彎曲菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157多重PCR分子檢測研究[J]. 檢驗醫(yī)學(xué), 2009, 24(2):101-105.

[13] 胡哲, 王振國, 劉金華, 等. 利用PCR技術(shù)檢測雞肉產(chǎn)品中的空腸彎曲桿菌[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 27(6):671-674.

[14] RAHN K, GRANDIS S A, CLARKE R C. Amplification of aninvAgene sequence ofSalmonella typhimuriumby polymerase chainreaction as a specific method of detection ofSalmonella[J]. Molecular and Cellular Probes, 1992, 6(4):271-279.

[15] DINJUS U, HANEL I, BAUERFEIND R, et al. Detection of the induction ofSalmonellaenterotoxin gene expression by contact with epithelial cells with RT-PCR[J]. FEMS Microbiol Lett, 1997, 146(2):175-179.

[16] 李鑫, 劉騫. 食源性沙門氏菌快速檢測技術(shù)[J]. 肉類研究, 2008(10):67-70.

[17] 侯建軍, 郝永清, 朱建國, 等. 空腸彎曲桿菌分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007, 34(11):87-90.

[18] 何蕊, 黃金林, 許海燕, 等. 彎曲菌多重PCR檢測方法的建立及其初步應(yīng)用[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報, 2007, 28(1):5-8.

[19] 邵碧英, 陳彬, 湯敏英, 等. 沙門氏菌多重PCR檢測方法的建立[J].食品科學(xué), 2007, 28(10):489-492.

Development of a Duplex PCR for Detection ofSalmonellaspp andCampylobacter jejuniin Food

CHEN Nuo1，TANG Shan-hu1,*，CHEN Jin-hui2，CEN Lu-jia1，LI Xue1，LONG Hu1
(1. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China；2. Dongguan Inspection and Quarantine Bureau, Dongguan 523072, China)

S855.11

A

1002-6630(2010)22-0403-04

2010-07-06

西南民族大學(xué)研究基金項目

陳諾(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：cn2003910@163.com

*通信作者：唐善虎(1964—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)與食品安全。E-mail：stang01@126.com