孫文敬，周延政，馮曉燕，魏 轉(zhuǎn)，余泗蓮，周 強

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.河北師范大學生命科學學院， 河北 石家莊 050016；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院制藥工程系，河北 石家莊 050026；4.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

旋光法測定發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸

孫文敬1，周延政1，馮曉燕2，魏 轉(zhuǎn)3，余泗蓮4，周 強4

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.河北師范大學生命科學學院， 河北 石家莊 050016；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學院制藥工程系，河北 石家莊 050026；4.百勤異VC鈉有限公司，江西 德興 334221)

通過測定發(fā)酵液的旋光度及其葡萄糖質(zhì)量濃度，計算發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的質(zhì)量濃度，并考察該方法實際應(yīng)用的可行性。結(jié)果表明：對照品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系，R2＞0.9999；該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，2-酮基-D-葡萄糖酸的平均回收率為102.60%，RSD為2.17%(n=5)。該方法可用于發(fā)酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸的定量檢測。

2-酮基-D-葡萄糖酸；葡萄糖；發(fā)酵液；旋光法；測定

Abstract：The 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth was calculated on the basis of glucose concentration determined by optical rotation degree. The application feasibility of polarimetry was also investigated. Results indicated that a good linear relationship between optical rotation degree and the concentration of 2-keto-D-gluconic acid and glucose (R2＞0.9999). The average recovery rate was 102.60% with RSD of 2.17%. This method has characteristics of precision, stability and reproducibility.Therefore, it can be used for determining 2-keto-D-gluconic acid in fermentation broth.

Key words：2-keto-D-gluconic acid；glucose；fermentation broth；polarimetry；determination

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)可作為飼料的富鈣添加劑、洗滌劑的促凈劑、水泥增塑劑和攝影顯影劑等。同時，2KGA還是生產(chǎn)除莠化合物、糠醛、D-阿拉伯糖、D-核酮糖和D-異抗壞血酸(erythorbic acid)及其鈉鹽(sodium erythorbate)的前體[1]。其中，作為食品添加劑D-異抗壞血酸(鈉)的前體是其最主要的用途。

在工業(yè)生產(chǎn)上，2KGA通常是由淀粉水解糖(葡萄糖)經(jīng)細菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化而來[2]。2KGA的質(zhì)量濃度是2KGA發(fā)酵過程控制的一個極其重要的參數(shù)，在整個發(fā)酵期間需要進行不斷的監(jiān)測。因此，建立準確、經(jīng)濟的2KGA定量測定方法是十分必要的。關(guān)于發(fā)酵液中2KGA的定量檢測，通常采用的方法有碘量法[3]、酸堿滴定法[3]、HPLC法[1]和酶法[4]等。雖然采用HPLC法和酶法可以實現(xiàn)發(fā)酵液中2KGA的快速、準確測定，但因其所需儀器昂貴或試劑成本較高而難以推廣；碘量法和酸堿滴定法的經(jīng)濟性和及時性能夠符合發(fā)酵過程控制的要求，但測定結(jié)果特別容易受到發(fā)酵液中葡萄糖的干擾，導(dǎo)致其準確度不夠。

早在20世紀40年代，Stubbs等[5]提出根據(jù)發(fā)酵液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度定量檢測2KGA的方法(即旋光法)。然而，限于采用的葡萄糖測定技術(shù)(Shaffer-Hartmann法)，該法并未得到普遍采用。

葡萄糖是食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)及臨床化學的一個常規(guī)而重要的檢測指標[6]。葡萄糖氧化酶(GOD)法、己糖激酶(HK)法、葡萄糖脫氫酶(GDH)法[7-10]等酶學方法已成為葡萄糖檢測的主流方法。葡萄糖的生物傳感分析技術(shù)是酶學方法與生物傳感器有機結(jié)合的產(chǎn)物，在醫(yī)藥、食品與發(fā)酵工業(yè)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[11-12]。本研究以生物傳感儀替代Shaffer-Hartmann法對葡萄糖進行檢測，在此基礎(chǔ)上對2KGA的旋光測定技術(shù)進行方法學考察，以期建立一種準確、經(jīng)濟的發(fā)酵液中2KGA的定量測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2KGA發(fā)酵液：采用文獻[2]方法自制；2KGA鈣鹽(HPLC法測定其中的2KGA含量為79.70%) 江西省德興市百勤異VC鈉有限公司；無水葡萄糖 北京精求化工有限責任公司；濃鹽酸 上海國藥試劑公司；其余試劑均為分析純；實驗溶液均以二次蒸餾水配制。

SBA-40型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；WZZ-1SS數(shù)字式自動旋光儀、PHS-3C型pH計 上海精密儀器有限公司；AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司；80-2型離心沉淀機 鞏義市予華儀器有限責任公司；CS501型超級恒溫水浴器 常州諾基儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

取一定量的2KGA發(fā)酵液，首先離心(4000r/min)20min以除去沉淀物。然后，取25mL的離心上清液與20mL的蒸餾水混合，攪動下用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值至1.5～1.6，再在60℃水浴中保溫30min。用冷水將其冷卻至25℃并用蒸餾水定容到100mL，再4000r/min離心30min，所得的上清液作為樣品溶液。

1.2.2 對照品溶液的制備

按照表1所示的不同配比，精密稱取各配比所需的無水葡萄糖和2KGA，將其分別加入45mL蒸餾水中。其他配制方法同1.2.1節(jié)樣品溶液的制備，依次得到對照品溶液1～8。

1.2.3 葡萄糖分析

在25℃條件下，采用生物傳感分析儀測定。

1.2.4 旋光度的測定

在25℃條件下，采用旋光儀測定。測定的光源為鈉燈D線，旋光管的管長為1dm。

1.2.5 pH值的測定

采用pH計測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 旋光度、葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系

依據(jù)Stubbs等[5]的研究結(jié)果，推測2KGA發(fā)酵液的旋光度與發(fā)酵液中的葡萄糖及2KGA質(zhì)量濃度之間應(yīng)該存在一定線性關(guān)系，即：

式中：Y為發(fā)酵液的旋光度/(°)；X1為發(fā)酵液中2KGA質(zhì)量濃度/(g/100mL)；X2為發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度/(g/100mL)；－0.88為1g/100mL 2KGA水溶液的旋光度/(°)；0.5275 為1g/100mL 葡萄糖溶液的旋光度/(°)。

利用Excel對對照品溶液旋光度的測定結(jié)果(表1)進行多元線性回歸，可以得到線性回歸方程：Y=－0.8849X1＋0.5244X2，這與Stubbs等[5]的研究結(jié)果吻合程度很高，并且R2＞0.9999，F(xiàn)檢驗與t檢驗的結(jié)果均為顯著，說明該線性回歸方程對實測值的擬合情況良好。

表1 對照品溶液的組成及其旋光度測定結(jié)果Table 1 Compositions and optical rotation degree of standard solution

2.2 精密度實驗

隨機抽取一種對照品溶液進行精密度實驗。重復(fù)5次取樣測定對照品溶液6的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，其RSD值分別為0.44%和0.73%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計算對照品溶液6中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為0.57%，表明精密度良好(表2)。

表2 精密度實驗結(jié)果Table 2 Precision determination of 2-KGA

2.3 穩(wěn)定性實驗

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Stability determination of 2-KGA

將樣品溶液在25℃分別放置0、30、60、90、120min，然后測定樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為3.26%和3.17%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為2.38%，可見樣品溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定性良好(表3)。

2.4 重現(xiàn)性實驗

取相同的發(fā)酵液5份，按1.2.1節(jié)方法分別進行處理，測定所得各個樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，RSD值分別為0.59%和2.30%；根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度，RSD值為0.62%，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好(表4)。

表4 重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 4 Reproducibility determination of 2-KGA

2.5 回收率實驗

表5 2KGA的加標回收率和相對標準偏差Table 5 Recovery rates and RSD of spiked samples

準確量取已知2KGA質(zhì)量濃度的發(fā)酵液125mL，精密加入0.6274g的2KGA鈣鹽(含2KGA 0.5000g，與發(fā)酵液混合前用5mL左右的蒸餾水溶解)，按1.2.1節(jié)方法制備樣品溶液，平行5份。測定各個樣品溶液的旋光度及葡萄糖質(zhì)量濃度，并根據(jù)所建立的線性回歸方程計算樣品溶液中的2KGA質(zhì)量濃度。計算結(jié)果表明，2KGA的5次平均回收率為102.60%，RSD為2.17%(表5)。

3 結(jié) 論

樣品溶液的旋光度、2-酮基-D-葡萄糖酸質(zhì)量濃度和葡萄糖質(zhì)量濃度之間存在良好的線性關(guān)系。2KGA的旋光法測定技術(shù)具有精密度高、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好、操作經(jīng)濟的特點，可用于發(fā)酵液中2KGA的定量測定。

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Determination of 2-Keto-D-gluconic Acid in Fermentation Broth by Polarimetry

SUN Wen-jing1，ZHOU Yan-zheng1，F(xiàn)ENG Xiao-yan2，WEI Zhuan3，YU Si-lian4，ZHOU Qiang4
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050016, China；3. Department of Pharmaceutical, Hebei Chemical and Pharmaceutical College, Shijiazhuang 050026, China；4. Parchn Sodium Isovitamin C Co. Ltd., Dexing 334221, China)

TQ921.2

A

1002-6630(2010)22-0375-03

2010-05-05

江蘇大學科研啟動基金項目(08JDG029)；江西省主要學科學術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)計劃項目(2008DD00600)；江西省科技支撐計劃項目(贛財教[2008]147號)

孫文敬(1964—)，男，研究員，博士，主要從事生物化工研究。E-mail：sunwenjing1919@163.com