王青豪，方 芳，張熊祿

(贛南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

微波輔助提取絞股藍黃酮工藝研究

王青豪，方 芳，張熊祿

(贛南師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000)

采用單因素試驗和正交試驗，進行微波輔助提取絞股藍黃酮的工藝研究，得到微波輔助提取絞股藍黃酮的最佳工藝條件：溶劑為30%乙醇溶液、料液比1:32(g/mL)、微波處理時間15min；在此工藝條件下絞股藍黃酮提取率為4.18%。與索氏提取法相比，微波輔助提取既能縮短提取時間又能提高絞股藍黃酮的提取率。

絞股藍；黃酮；微波輔助提??；工藝

Abstract：Microwave-assisted extraction of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas explored by single factor and orthogonal experiments. The optimal extraction processing parameters were 30% ethanol as solvent, material-liquid ratio of 1:32 (g/mL), and microwave treatment time of 15 min. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllumwas 4.18%. Compared with traditional extraction method, microwave-assisted extraction can shorten extraction time and improve the extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum.

Key words：Gynstemma pentaphyllum；flavonoids；microwave-assisted extraction；processing technology

絞股藍[Gynostemma pentaphyllum(Thunb.) Makino]是葫蘆科絞股藍屬的多年生草質(zhì)藤本植物，素有“南方人參”之美稱。絞股藍性寒、味甘、微苦，歸肺、脾、心、腎經(jīng)，有補氣養(yǎng)陰、清肺化痰、養(yǎng)心安神之功效[1]。在絞股藍的活性成分中，黃酮類化合物是除皂苷、多糖外的另一種主要活性成分，尤其葉中含量最多，但對絞股藍黃酮類化合物的研究較少[2-3]。

國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃酮類化合物有數(shù)千種，其中大多數(shù)具有顯著的生理活性，對一些常見病、多發(fā)病有重要的生理作用，如有抗氧化和清除氧自由基作用；抗癌、防癌作用；改善心腦血管循環(huán)、擴張冠狀動脈血管、松弛支氣管、利尿以及明顯的抗血小板活化因子等作用[4-5]。

傳統(tǒng)的黃酮提取方法有浸提法、索氏法和回流法等[6-7]。微波提取技術(shù)能強化浸提過程，具有加熱快且均勻、節(jié)能、產(chǎn)率高等優(yōu)點，該技術(shù)既能降低操作費用，又合乎環(huán)境保護的要求，是一種有良好發(fā)展前景的新工藝，已被廣泛應(yīng)用于植物有效活性成分提取。采用微波技術(shù)能提高天然產(chǎn)物的萃取效率，與常規(guī)方法相比可大大縮短提取所需的時間[8-10]。本研究采用微波輻射從絞股藍茶葉中提取黃酮類化合物，期望為絞股藍黃酮的進一步精制及其應(yīng)用研究提供依據(jù)[11-14]。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

絞股藍茶葉(產(chǎn)自粵北丹霞山)。蘆丁、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純)、氫氧化鈉。

722光柵分光光度計 上海第三儀器廠；三樂牌WP650D家用微波爐(經(jīng)南京藍通科工貿(mào)有限公司改裝)；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[15-16]

準(zhǔn)確稱取0.1326g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品，用30%乙醇溶解并定容于500mL棕色容量瓶中，待用。分別移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL于6只50mL容量瓶中，各加入1.0mL 50g/L NaNO2溶液混勻，放置6min后加入1.0mL 100g/L Al(NO3)3溶液混勻，放置6min，再加入10.0mL 40g/L NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于500nm波長處測其吸光度A，以蘆丁質(zhì)量濃度Y(g/L)為縱坐標(biāo)、吸光度A為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蘆丁質(zhì)量濃度Y(g/L)與吸光度A的線性回歸方程為：Y=0.1078A+0.00314(r=0.9995)，蘆丁質(zhì)量濃度Y在0.0053～0.0424g/L范圍內(nèi)與吸光度A之間有較好的線性關(guān)系。

1.2.2 絞股藍黃酮提取工藝流程

絞股藍茶葉→稱量→溶劑浸泡→微波處理→過濾除雜→回收乙醇→濃縮液用水定容→分光光度法檢測提取液中的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)→計算黃酮提取率

1.2.3 索氏提取法

采用索氏提取器提取絞股藍茶葉中的總黃酮，提取液按制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色后測其吸光度A，代入回歸方程計算其黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)及總黃酮質(zhì)量，再除以原料絞股藍茶葉的質(zhì)量即為絞股藍茶葉中總黃酮的百分含量(索氏提取法的黃酮提取率)，據(jù)此與微波輔助法進行比較。

1.2.4 微波輔助提取單因素試驗

在微波輻射功率固定、絞股藍茶葉粒度固定的條件下，影響黃酮提取率的因素有提取次數(shù)、溫度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波輻射時間等。在一次提取絞股藍黃酮時，物系溫度隨微波輻射時間(微波功效)而升高。因此本實驗僅考查乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和微波時間對絞股藍黃酮提取率的影響。

1.2.5 微波輔助提取工藝條件的正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果與分析選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時間3個因素，各設(shè)定3個水平進行正交試驗。

選用250mL圓底燒瓶，每次試驗固定溶劑體積160mL，根據(jù)不同的料液比而改變原料質(zhì)量。為了控制回流高度，微波爐采用20%功率檔(每30s只輻射6s，間隔24s。微波功效為130W/min)。提取液根據(jù)各組實驗情況回收乙醇，濃縮液用蒸餾水定容至500mL，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%的乙醇定容于50mL后檢測其吸光度，按1.2.6節(jié)公式計算黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黃酮提取率。

1.2.6 黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)和黃酮提取率的計算公式

提取液中黃酮質(zhì)量濃度C/(g/L)=(0.1078A+0.00314)×25

2 結(jié)果與分析

2.1 索氏法提取絞股藍黃酮

準(zhǔn)確稱取干燥有固定粒度的5.0g絞股藍茶葉，用脫脂濾紙包好放入索氏抽提器中，用95%乙醇160mL抽提14h，至虹吸管中無顏色為止。提取液回收乙醇后用蒸餾水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，測得吸光度為0.093，按1.2.6節(jié)的方法計算黃酮提取率。提取液中黃酮質(zhì)量濃度C=0.329g/L，黃酮提取率為3.29%，即以95%乙醇為溶劑，采用傳統(tǒng)的索氏提取法，絞股藍黃酮的提取率是3.29%。

2.2 微波輔助提取單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對絞股藍黃酮提取率的影響

精確稱取干燥有固定粒度的5.0g絞股藍茶葉放入250mL圓底燒瓶內(nèi)，加入溶劑浸泡至絞股藍茶葉充分濕潤后再進行微波輔助提取絞股藍黃酮。為了控制回流高度，微波爐采用20%功率檔(每30s只輻射6s，間隔24s。微波功效為130W/min)。在固定條件下：料液比1:24(g/mL)、微波時間30min，分別用95%、60%、30%和0%(純水)乙醇進行微波輔助提取黃酮，過濾除渣，提取液回收乙醇后用蒸餾水定容于500mL容量瓶中，取2.0mL按制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法顯色，最后用30%乙醇定容于50mL容量瓶中，測定吸光度，按1.2.6節(jié)方法計算黃酮提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由圖1可以看出，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率先是增加而后則緩慢降低，這是因為黃酮類化合物為多羥基酚類其極性比乙醇強而比水弱，較易溶于中等體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液。另外，用純水時得到的提取液泡沫多，難過濾，其原因是提取液含有較多的多糖和氨基酸。而用95%乙醇時，皂苷、色素及其他脂溶性物質(zhì)溶出也較多，而且溶劑的揮發(fā)性大，生產(chǎn)成本也提高。因此，初步確定30%～60%的乙醇為合適的溶劑。

2.2.2 料液比對絞股藍黃酮提取率的影響

圖2 料液比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

在固定條件下：30%乙醇、微波時間30min，分別以料液比1:32、1:24、1:16、1:8(g/mL)，按2.2.1節(jié)方法進行微波輔助提取并檢測黃酮，并按1.2.6節(jié)方法計算黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨液體量的增大提取率也增大，提取率先是增加較多而后趨近于最大值，這是因為液體量太低時溶劑不能完全溶脹原料以及完全溶解出黃酮，但太高時又增加生產(chǎn)成本以及增加后續(xù)處理的難度。因此，初步確定1:32～1:16(g/mL)為合適的料液比。

2.2.3 微波時間對絞股藍黃酮提取率的影響

按2.2.1節(jié)方法，在固定條件下：30%乙醇、料液比1:24(g/mL)，分別用60、30、15、5min微波輔助提取并檢測黃酮，并按1.2.6節(jié)方法計算黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 微波時間對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave treatment time on extraction rate of flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

由圖3可以看出，隨微波時間的增加提取率先是增加較多，達到最大值后隨著微波時間的增加提取率反而有所下降。這是因為微波的作用機制是微波直接作用于分子，使分子的熱運動加劇，從而引起溫度升高，可以快速破壞細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分更快的分離浸提出來。當(dāng)微波時間達到15min以上時細(xì)胞破裂完全，細(xì)胞內(nèi)的有效成分大部分可浸提出來。但試驗時發(fā)現(xiàn)，微波時間為60min時絞股藍茶葉有焦化現(xiàn)象，黃酮提取率反而降低，這可能是長時間輻射后絞股藍茶葉中的有效成分結(jié)構(gòu)被破壞的結(jié)果。因此，初步確定10～20min為合適的微波處理時間。

2.3 微波輔助提取工藝正交試驗

表1 L9(33)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

由表2中的平均值k和極差R分析表明：正交試驗考察的3個因素對微波輔助提取絞股藍黃酮影響大小順序為料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波時間。得出的最佳提取工藝組合是乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1:32(g/mL)、微波處理時間15min。為考察正交試驗得出的最佳工藝條件的穩(wěn)定性，以最佳工藝條件做重復(fù)實驗，在此條件下絞股藍黃酮的提取率為4.18%，說明正交試驗設(shè)計合理有效。

表2 L9(33)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

料液比1:32(g/mL)與1:24(g/mL)的平均提取率k相差很小，因此，若在實際工業(yè)生產(chǎn)中，參照最佳工藝條件，為節(jié)省溶劑以及減輕后續(xù)處理，也可選擇30%乙醇、料液比1:24(g/mL)、100%功率檔(微波功效為650W/min)微波輔助提取3min，同樣也可以達到較好的提取效果，此條件下的黃酮提取率是4.13%。

以絞股藍茶葉為原料，索氏法提取14h，其黃酮提取率是3.29%；而用微波輔助法提取15min，黃酮提取率為4.18%。比較可知：微波輔助提取既能縮短提取時間又能提高絞股藍黃酮的提取率。

3 結(jié) 論

微波輔助提取法經(jīng)正交試驗優(yōu)化后的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、料液比1:32(g/mL)、微波處理時間15min。此工藝條件下絞股藍黃酮提取率為4.18%。微波輔助提取法與索氏提取法相比，微波輔助提取既能縮短提取時間又能提高絞股藍黃酮的提取率。

[1] 陳武, 鄒盛勤, 吳曉春, 等. 絞股藍無糖口含片的制備工藝研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(3):245-248.

[2] BAI Mingsheng, GAO Jinmin, FAN Chen, et al. Bioactive dammarane-type triterpenoids derived from the acid hydrolysate ofGynostemma pentaphyllumsaponins[J]. Food Chemistry, 2010, 119(11):306-310.

[3] LU You, YANG Xingbin, ZHAO Yan, et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides fromGynostemma pentaphyllumby HPLC with indirect UV detection[J].Food Chemistry, 2009, 112:742-746.

[4] 周建華, 張興亞. 絞股藍開發(fā)研究新進展及應(yīng)用[J]. 食品科技, 2010,35(2):74-76.

[5] 徐寧, 張峰, 肖遠勝, 等. 中藥黃酮類化合物[J]. 大學(xué)化學(xué), 2010, 25(4):105-108.

[6] 陳業(yè)高. 植物化學(xué)成分[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2004.

[7] 劉成梅, 游海. 天然產(chǎn)物有效成分的分離與應(yīng)用[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2003.

[8] 金欽漢. 微波化學(xué)[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1999.

[9] 池愛平, 陳錦屏. 微波輔助提取絞股藍多糖的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(7):181-184.

[10] 朱遠平. 金柚皮總黃酮的微波輔助提取工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2009,30(12):73-77.

[11] 柳嘉, POPOVICH D G, 景浩. 山楂黃酮提取物的抗氧化活性和對癌細(xì)胞生長抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(3):220-223.

[12] 葉春, 張婧. 大孔樹脂對野菊花總黃酮吸附分離特性的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(12):127-131.

[13] 陳蕉, 黎云祥, 陳光登, 等. 大孔吸附樹脂分離純化峨嵋?guī)r白菜葉總黃酮[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(6):74-79.

[14] 劉志祥, 曾超珍, 張玥. AB-8大孔樹脂分離純化枸骨葉總黃酮的工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(12):76-79.

[15] 盧錦花, 胡小玲, 岳紅, 等. 大孔吸附樹脂對銀杏葉黃酮類化合物吸附及解吸的研究[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用, 2002, 14(2):164-166; 148.

[16] 胡志軍, 郝利君, 王南溪, 等. D-101大孔吸附樹脂分離純化橘皮中的黃酮類物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(8):65-69.

Microwave-assisted Extraction of Flavonoids fromGynstemma pentaphyllum

WANG Qing-hao，F(xiàn)ANG Fang，ZHANG Xiong-lu
(College of Chemistry and Life Science, Gannan Normal University, Ganzhou 341000, China)

O629.9

A

1002-6630(2010)22-0149-04

2010-06-30

王青豪(1963—)，男，教授，學(xué)士，主要從事有機化學(xué)與天然產(chǎn)物研究。E-mail：wang_qing_hao@yahoo.cn