楊萬根，王衛(wèi)東，孫會剛，馬美湖*

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

富血紅素多肽產(chǎn)物制備用酶的比較研究

楊萬根1，王衛(wèi)東1，孫會剛1，馬美湖2,*

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

為篩選適于生產(chǎn)富血紅素多肽產(chǎn)物的蛋白酶，比較不同蛋白酶對豬血紅蛋白的水解效果。在AS1398中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的最適水解pH值及溫度下，以L16(45)正交試驗研究酶種類、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水解時間等因素對水解率、水解液中粗多肽含量和血紅素含量等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：酶種類和水解時間兩因素對水解率指標(biāo)的影響達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是影響粗多肽含量指標(biāo)的最重要因素；酶種類對血紅素含量指標(biāo)的影響則達(dá)到顯著性水平(P＜0.05)。中性蛋白酶有利于提高水解率，木瓜蛋白酶有利于提高水解物的粗多肽含量，而堿性蛋白酶則有利于提高水解物的血紅素含量。

豬血紅蛋白；蛋白酶；多肽；血紅素；篩選

Abstract：In order to screen a protease suitable for producing heme-enriched polypeptides, the effects of various proteases on hydrolysis efficiency of porcine hemoglobin were compared. Under the optimal pH and temperature of proteases such as AS1398 neutral protease, 2709 alkaline protease, papain and trypsin, orthogonal experiments were used to explore the effects of enzyme type, enzyme concentration, substrate concentration and hydrolysis time on the hydrolysis degree of porcine hemoglobin and the contents of polypeptides and heme. Results showed that the effects of enzyme type and hydrolysis time on the degree of hydrolysis reached an extremely significant level (P＜ 0.01). Substrate concentration was the most important factor to affect the content of polypeptide production. The effect of enzyme type on heme content reached a significant level(P＜ 0.05). Neutral protease is beneficial for the increase of hydrolysis degree and papain is good for the increase of polypeptide content, while alkali protease is helpful for the increase of heme content.

Key words：porcine hemoglobin；proteases；polypeptide；heme；screening

豬血紅蛋白占全血蛋白質(zhì)總量的2/3以上，是豬血中的重要營養(yǎng)成分。血紅蛋白由珠蛋白和血紅素兩部分構(gòu)成，經(jīng)過現(xiàn)代生物酶解技術(shù)，血紅蛋白在被降解成多肽的同時，釋放出血紅素或血紅素肽[1]。已有研究證明，豬血紅蛋白多肽具有降血壓[2]、抗氧化[3]、抗菌[4]和增強免疫力[5]等多種生物活性，血紅素或血紅素肽則是一種優(yōu)良的補鐵劑[6]。目前，國內(nèi)屠宰場每年產(chǎn)生大量的豬血，這些豬血大部分未經(jīng)利用被直接排放入環(huán)境中，既浪費了寶貴的蛋白質(zhì)資源，又造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。對豬血紅蛋白開展酶法生產(chǎn)富血紅素多肽研究，能變廢為寶，具有巨大的經(jīng)濟價值和重大環(huán)保意義。國內(nèi)外對酶法水解豬血紅蛋白制備富血紅素多肽的研究正方興未艾[7-8]。本實驗研究酶種類、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水解時間對水解率、水解液中粗多肽含量和血紅素含量的影響，比較不同蛋白酶降解豬血紅蛋白的效果，為利用屠宰廠廢棄豬血制備富血紅素多肽產(chǎn)品提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗血紅蛋白 自制[9]；木瓜蛋白酶 廣州遠(yuǎn)天酶制劑廠；AS1398中性蛋白酶和2709堿性蛋白酶 北京房山酶制劑廠；胰蛋白酶 上海實驗試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；LD5-2型醫(yī)用離心機 北京醫(yī)用離心機廠；微量凱氏定氮裝置 泉州市萬達(dá)實驗儀器設(shè)備；JB300-D型強力電動攪拌機、DS-1型組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠；754型分光光度計 上海分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗設(shè)計

選用L16(45)正交表[10]考察酶種類、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水解時間等因素對水解率、粗多肽含量以及血紅素含量等指標(biāo)的影響，試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.2 豬血紅蛋白水解方法

用適量水稀釋豬血紅蛋白解凍液，85℃加熱30min，搗碎，加水調(diào)至一定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，加熱至蛋白酶水解溫度，并調(diào)節(jié)至水解pH值，加入一定濃度的蛋白酶水解，水解過程中滴加堿液保持pH值不變。到達(dá)一定水解時間后，90℃加熱15min滅酶。4000r/min離心20min得豬血紅蛋白水解液。

1.3.3 酶活測定

測定方法采用福林-酚法[11]。酶活單位(U)定義為：在各蛋白酶的最適水解pH值及溫度的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

1.3.4 總氮測定

改良凱氏定氮法[12]。

1.3.5 氨基氮測定

甲醛滴定法[12]。

1.3.6 血紅素含量測定

分光光度法[13]。

1.3.7 水解率公式

1.3.8 粗多肽含量測定

豬血紅蛋白水解液中主要成分是多肽，另外還含有少量的游離氨基酸和未降解的蛋白質(zhì)，因此測定的是粗多肽的含量。粗多肽含量=總氮含量×6.25。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

2.2 水解率分析

表3 水解率方差分析表Table 3 Variance analysis of hydrolysis degree

水解率的方差分析結(jié)果見如表3所示。對水解率指標(biāo)，各因素的影響：酶種類＞水解時間＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中酶種類和水解時間的影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。水平均值多重比較分析顯示，酶種類的影響：中性蛋白酶＞堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶，中性蛋白酶與其他3種蛋白酶呈極顯著性差異(P＜0.01)；水解時間的影響：13h＞10h＞7h＞4h，其中13h和10h之間無顯著差異(P＞0.05)，它們均與7h呈顯著性差異(P＜0.05)，而7h又和4h呈顯著性差異(P＜0.05)；底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響：6%＞8%＞10%＞4%，前三水平與4%的達(dá)到了顯著性差異(P＜0.05)；酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的各水平之間無顯著性差異(P＞0.05)，各水平效果：2000U/g＞6000U/g＞4000U/g＞8000U/g。因此對水解率指標(biāo)，最優(yōu)的因素水平組合：中性蛋白酶、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2000U/g、水解時間13h。

AS1398中性蛋白酶是微生物來源的蛋白酶，其水解特異性較寬，可以水解底物成小分子的肽或游離氨基酸，因此其對水解率指標(biāo)影響最大。有試驗證明中性蛋白酶具有較強的水解能力，如劉昭明等、鄧佳等在豬血紅蛋白的水解研究中發(fā)現(xiàn)，AS 1398中性蛋白酶比木瓜蛋白酶具有更高的水解率[15-16]。

2.3 粗多肽含量分析

表4 粗多肽含量極差分析Table 4 Range analysis of polypeptide contents

粗多肽含量的極差分析結(jié)果如表4所示。由R值比較可知，對粗多肽含量指標(biāo)，各因素的重要性：底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶種類＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞水解時間。根據(jù)比較K值，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的的優(yōu)劣：8%＞10%＞6%＞4%；酶種類各水平的優(yōu)劣：木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶；酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的優(yōu)劣：4000U/g＞8000U/g＞6000U/g＞2000U/g；水解時間各水平的優(yōu)劣：7h＞13h＞10h＞4h。因此，對粗多肽含量指標(biāo)，最優(yōu)的因素組合：木瓜蛋白酶、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)4000U/g、水解時間7h。

從粗多肽含量指標(biāo)來看，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%和10%的效果優(yōu)于4%和6%，這是由于在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于8%時，酶還沒有被底物完全飽和。據(jù)Henri解釋，在低底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，并非所有的酶分子能與底物結(jié)合；隨底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶分子與底物相結(jié)合的數(shù)量增加，當(dāng)所有的酶分子與底物相結(jié)合時，這時的催化速度最大[17]。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時，豬血紅蛋白形成稠狀的物料，流動性差，不利酶的連續(xù)作用，因此其水解效果比底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時較差。木瓜蛋白酶是提高水解物中粗多肽含量的最適酶類，其原因是該酶為內(nèi)切酶，能酶切蛋白質(zhì)肽鏈成小肽段，使水溶性固形物增多，導(dǎo)致粗多肽含量指標(biāo)提高。胰蛋白酶同樣為內(nèi)切酶，但其只能催化水解底物蛋白質(zhì)分子中由Lys-或Arg-殘基所構(gòu)成的肽鍵，底物特異性太強[8]，因此對粗多肽含量指標(biāo)的影響要小于木瓜蛋白酶。

2.4 血紅素含量分析

表5 血紅素含量方差分析Table 5 Variance analysis of heme contents

血紅素含量指標(biāo)的方差分析結(jié)果見表5，各因素的影響：酶種類＞酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞水解時間＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，且只有酶種類一項達(dá)到顯著性水平(P＜0.05)，而其他因素的影響不顯著(P＞0.05)。水平均值多重比較表明，酶種類各水平的優(yōu)劣：堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，且堿性蛋白酶與中性蛋白酶、胰蛋白酶之間呈顯著性差異(P＜0.05)，與木瓜蛋白酶無顯著性差異(P＞0.05)。其他因素的水平之間均無顯著性差異，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的優(yōu)劣：4000U/g＞8000U/g＞6000U/g＞2000U/g，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)各水平的優(yōu)劣：4%＞10%＞8%＞6%，水解時間各水平的優(yōu)劣：4h＞7h＞13h＞10h。因此對血紅素指標(biāo)，最優(yōu)的條件組合：堿性蛋白酶、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)4000U/g、4%底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時間4h。

實驗中一個顯著的現(xiàn)象是影響血紅素指標(biāo)的酶類順序：堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶，它們作用的pH值依堿性到中性順序排列。一般認(rèn)為在堿性環(huán)境中，由于蛋白質(zhì)分子中各基團(tuán)具有相同的電荷，靜電排斥作用使珠蛋白的結(jié)構(gòu)伸展，暴露出珠蛋白肽鍵上更多的酶作用位點，從而使更多的血紅素從血紅蛋白中被釋放出來。張亞娟[18]在研究酶法水解血紅蛋白制備血紅素時發(fā)現(xiàn)，堿性蛋白酶是制備血紅素的最優(yōu)酶類。孫騫等[19]報道，木瓜蛋白酶的水解液色澤要好于AS1398中性蛋白酶、胰蛋白酶等，水解液的色澤排列順序是木瓜蛋白酶＞AS1398中性蛋白酶＞胰蛋白酶，說明木瓜蛋白酶血紅素釋放的能力要大于AS1398中性蛋白酶和胰蛋白酶，與本實驗的結(jié)果一致。李寶臻[20]采用酶解方法對豬血球蛋白進(jìn)行脫色研究時發(fā)現(xiàn)，在所選擇的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶中，堿性蛋白酶和中性蛋白酶有較好的脫色效果，堿性蛋白酶的脫色率達(dá)到了90%以上，同樣說明了堿性蛋白酶有利于血紅素的釋放。

3 結(jié) 論

采用酶解技術(shù)水解屠宰場廢棄豬血中的血紅蛋白生產(chǎn)富血紅素多肽產(chǎn)品，具有重大的經(jīng)濟價值和環(huán)保意義。本實驗比較了AS1398中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解效果，考察了酶種類、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水解時間對水解率、粗多肽含量和血紅素含量等因素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶種類是影響水解率和血紅素含量指標(biāo)的重要因素，其對水解率指標(biāo)的影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)，對血紅素含量指標(biāo)的影響達(dá)到顯著性水平(P＜0.05)。不同蛋白酶具有不同的水解效果。酶種類各水平中，對水解率指標(biāo)，中性蛋白酶是最優(yōu)水平；對水解物的粗多肽含量指標(biāo)，木瓜蛋白酶是最優(yōu)水平；對水解物的血紅素含量指標(biāo)，堿性蛋白酶是最優(yōu)水平。本研究結(jié)果對富血紅素多肽生產(chǎn)具有一定參考價值。

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Comparison of Proteases for Hydrolyzing Porcine Hemoglobin

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Hui-gang1，MA Mei-hu2,*
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

TS251.93

A

1002-6630(2010)22-0156-04

2010-01-24

國家自然科學(xué)基金項目(30270976)

楊萬根(1974—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yangwangen08@163.com

*通信作者：馬美湖(1957—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn