王 昱,盧仲毅,許 峰,朱宇迪,朱宇熹

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院兒科,重慶400038;重慶醫(yī)科大學(xué):2.兒童醫(yī)院急診科;3.兒童醫(yī)院藥劑科 400014;4.附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

羥基脲對體外Hela細(xì)胞周期同步化作用的研究

王 昱1,2,盧仲毅2,許 峰2,朱宇迪3,朱宇熹4,5△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院兒科,重慶400038;重慶醫(yī)科大學(xué):2.兒童醫(yī)院急診科;3.兒童醫(yī)院藥劑科 400014;4.附屬第一醫(yī)院腫瘤科 400016;5.Department of Radiation Oncology&Ⅰmage-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,Japan)

目的 探討利用羥基脲(HU)對 Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期同步化。方法 培養(yǎng) Hela細(xì)胞,采用 Hu處理 Hela細(xì)胞24 h,然后除去 HU,讓 Hela細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期 G1、S、G2/M期,通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)。結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測證實(shí) Hela細(xì)胞在HU祛除后3.5 h處于S期,8.5 h處于 G2/M期,18 h處于 G1期。結(jié)論 HU處理可以有效地將 Hela細(xì)胞同步化于特定的細(xì)胞周期,而且方法簡單,易于操作。

羥基脲;Hela細(xì)胞;細(xì)胞周期;同步化

細(xì)胞增殖分裂是細(xì)胞基本的生理活動,細(xì)胞周期的紊亂導(dǎo)致許多疾病[1],各種調(diào)控因子通過作用于細(xì)胞周期而產(chǎn)生作用[2]。腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一,從細(xì)胞周期的角度出發(fā),探討不同細(xì)胞周期腫瘤細(xì)胞在侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的細(xì)胞生物學(xué)特性的變化,可為腫瘤的治療提供定量的參考依據(jù)[1]。在體外細(xì)胞水平的研究中,將細(xì)胞同步化于特定的細(xì)胞周期,可以為各種細(xì)胞因子、藥物、放射的實(shí)驗(yàn)提供理想的實(shí)驗(yàn)對象[3]。為了研究某一時相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡,常需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時相,即細(xì)胞同步化技術(shù)[4-5]。采用羥基脲(hydroxyurea,HU)這種DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn),最終可將細(xì)胞群體阻斷在 G1/S期交界處[6-7],然后將含 HU的培養(yǎng)基置換出來,釋放細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng),按照Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期分布在不同的時間段設(shè)計(jì)時程作流式細(xì)胞術(shù)檢測,以判斷細(xì)胞所處的周期。作者經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)建立了Hela細(xì)胞同步化的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑 Hela細(xì)胞株(HeLa human cervical epithelial adenocarcinoma cell line)購自 the American Type Culture Collection。于RPMI1640培養(yǎng)基(Promega含10%的熱滅活小牛血清、100 u/mL青霉素及100 u/mL鏈霉素)、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.2 根據(jù) Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期設(shè)計(jì)檢測細(xì)胞周期的時程Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期分布是 S期9 h,G1期8 h,G2/M 4 h。Hu處理后的細(xì)胞處于 G1、S期的交界處,故設(shè)計(jì)時程為:HU釋放后立即以及 3.5、8.5、10、11.5、14、16、18、20、22、24 h。

1.3 細(xì)胞同步化方法

1.3.1 一次阻斷后釋放法 采取 HU處理24 h,阻斷后釋放的方法。其簡要步驟如下:培養(yǎng) Hela細(xì)胞至對數(shù)生長期、傳代、接種入6孔培養(yǎng)盤,濃度為5×104/mL,加入 HU至其終濃度為1 mmol/L,在上述條件下培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液,以PBS液清洗細(xì)胞后加入新鮮培養(yǎng)液,然后繼續(xù)培養(yǎng)至各個時間點(diǎn)。

1.3.2 兩次阻斷后釋放法 接種 Hela細(xì)胞入6孔培養(yǎng)盤,濃度為5×104/mL,采取 HU終濃度為1 mmol/L處理24 h,棄去培養(yǎng)液,以PBS液清洗細(xì)胞后加入新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)10 h,然后再用 HU處理14 h,然后釋放 Hela細(xì)胞。把未用 HU處理的樣本作為對照。

1.4 同步率檢測

1.4.1 收集細(xì)胞 達(dá)到時間點(diǎn)后,棄上清液,1×PBS+EDTA清洗,0.02%EDTA、25%胰蛋白酶消化收集,PBS液沖洗,以70%乙醇固定,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 流式細(xì)胞儀檢測 流式細(xì)胞術(shù)PI染色技術(shù),流式細(xì)胞儀(BD Bioscience)檢測各時相中細(xì)胞的比例,每次分析1×104個細(xì)胞,應(yīng)用 Cell Quest software(BD Bioscience)分析軟件分析。

2 結(jié) 果

分別采用一次阻斷和兩次阻斷法阻斷后,測定立即以及3.5、8.5 h的結(jié)果。結(jié)果顯示兩次阻斷法相對于一次阻斷法步驟較復(fù)雜,處理的時間太長,使細(xì)胞容易過度生長。就FACS的結(jié)果來說 HU一次阻斷法后細(xì)胞周期的阻斷效果好,因此就采用一次阻斷法繼續(xù)研究。一次阻斷法后8.5、10、11.5 h 3個時間點(diǎn)的細(xì)胞周期分布見圖1。兩次阻斷法后18、20、22 h 3個時間點(diǎn)的細(xì)胞周期分布。18 h時間點(diǎn),細(xì)胞主要在 G1期(圖2)。綜合各個時間點(diǎn)的流式細(xì)胞儀分析,3.5、8.5、18 h 3個時間點(diǎn),細(xì)胞主要在S期、G2/M期和 G1期(圖3)。

圖1 HU一次阻斷法+8.5、10、11.5 h

圖2 HU一次阻斷法+18、20、22 h

圖3 HU處理同步 Hela細(xì)胞于 G1、S、G2/M期

3 討 論

細(xì)胞的增殖分裂受生長因子、激素及癌基因產(chǎn)物影響,從而影響細(xì)胞周期的運(yùn)行。當(dāng)調(diào)控因子造成細(xì)胞周期的快速運(yùn)行,將導(dǎo)致良性或惡性的增生;而細(xì)胞周期停滯不前則導(dǎo)致細(xì)胞衰老、凋亡。因此,觀察各種調(diào)控因子對細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)的影響和從細(xì)胞周期的角度來觀察調(diào)控運(yùn)轉(zhuǎn)對細(xì)胞的增殖、分裂、凋亡等行為的影響非常重要。體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化法是重要的研究細(xì)胞周期的方法,其基本原理是使細(xì)胞停止在細(xì)胞周期的某一時相,目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞動力學(xué)、人類高分辨染色體、成熟前積聚染色體以及細(xì)胞不同時相對藥物敏感性等方面的研究。哺乳動物細(xì)胞和人體細(xì)胞的同步化方法,包括溫度休克、照射、胰酶消化、藥物抑制、機(jī)械振動收集分裂細(xì)胞等,且常常需要幾種方法聯(lián)合應(yīng)用,以同步細(xì)胞到特定的細(xì)胞周期。

細(xì)胞周期特異性的抗癌藥物抑制細(xì)胞周期的機(jī)制是特異性阻斷細(xì)胞周期的特定階段,例如阻斷S期的 HU、甲氨蝶呤等;阻斷M期的有紫杉醇、秋水仙素等。HU是尿素的羥基化產(chǎn)物,相對分子質(zhì)量為76 u,是用于臨床的核糖核苷酸還原酶抑制劑類抗腫瘤藥物,可以阻止核苷酸還原為脫氧核苷酸,因而選擇性地抑制DNA的合成,并能直接損傷DNA。因本品作用于S期,并能使部分細(xì)胞阻滯在 G1/S期的邊緣,故可用作使腫瘤細(xì)胞部分同步化或放射增敏的藥物[8]。本研究采用HU阻斷 Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期,然后釋放,Hela細(xì)胞就隨著釋放后的時程,進(jìn)入各個細(xì)胞周期,經(jīng)過多次重復(fù)的實(shí)驗(yàn),細(xì)胞的同步率均能穩(wěn)定,細(xì)胞的同步水平幾乎不會改變,表明這一同步化法能夠滿足實(shí)驗(yàn)條件的要求。

HU作為臨床上治療慢粒、真性紅細(xì)胞增多癥的主要用藥之一[9],對頭頸部原發(fā)性鱗癌、復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移性卵巢癌等亦有一定療效[10],還可作為放射增敏劑增加放療對頭頸部腫瘤的療效[11-12]。目前在臨床上,放、化療的時程安排仍然是有待解決的問題。放療對 G2/M期細(xì)胞敏感,對S期細(xì)胞不敏感,如果時程安排不當(dāng),可能造成放、化療的作用相拮抗[13-14],從而降低治療腫瘤的療效。如何才能達(dá)到最佳的協(xié)同效果,合理安排放、化療的時程非常重要[15]。將 HU作用于腫瘤細(xì)胞(Hela細(xì)胞)24 h,然后系統(tǒng)地用流式細(xì)胞儀觀察其對 Hela細(xì)胞周期的影響,對于安排放、化療時程能夠起到參考作用。本課題下一步將就HU同步化動物在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究,以期為臨床治療提供更有價值的依據(jù)和指導(dǎo)。

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Synchronization of the cell cycle of Hela cell by hydroxyurea in vitro

WANG Yu1,2,LU Zhong-yi2,XU Feng2,et al.
(1.Department ofPediatric,the Southwest Hospital,the Third military Medical University,Chongqing400038,China;2.Department of Emergency,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;3.Department ofPharmacology,Chongqing Medical University Affiliated Children′s Hospital,Chongqing400014,China;4.Department of Oncology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing400016,China;5.Department of Radiation Oncology&Image-applied,Therapy Kyoto University Graduate School of Medicine,J apan)

Objective To explore the method to synchronize Hela cell by hydroxyurea.Methods Culture Hela cell,add HU 1 nm to the culture medium,synchronized the Hela cell for 24 h,then release HU from the culture medium.Design the specific time course for Hela cell;proved by flow cytometry.Results After release HU,3.5 h later,Hela cell could be synchronized in S phase,8.5 h later in G2/M phase,and 18 h later in G1phase.Conclusion Hela cell can be successfully synchronized in G1,S,G2/M phase by the HU treatment and releasing.

hydroxyurea;hela cell;cell cycle;synchronization

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.24.012

R329.28;R979.1

A

1671-8348(2010)24-3331-02

△通訊作者,E-mail:zhuyuxi17@hotmail.com。

2010-06-23

2010-08-25)