馬亞琴，王華，吳厚玖，孫志高，黃學根，郭莉

(中國農(nóng)業(yè)科學院柑橘研究所國家柑橘工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)

生產(chǎn)柑橘皮渣發(fā)酵飼料的多菌種優(yōu)化培養(yǎng)條件*

馬亞琴，王華，吳厚玖，孫志高，黃學根，郭莉

(中國農(nóng)業(yè)科學院柑橘研究所國家柑橘工程技術(shù)研究中心，重慶，400712)

以麥芽汁、馬鈴薯、紅薯為原料配制液體培養(yǎng)基，主要篩選了培養(yǎng)康寧木霉(13016)、黑曲霉(2281)、酵母(1254)等微生物的最佳培養(yǎng)基及擴大培養(yǎng)條件，旨在降低柑橘皮渣發(fā)酵飼料成本。試驗結(jié)果表明:在30℃培養(yǎng)56 h，以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基，木霉產(chǎn)孢量最高;以麥芽汁為培養(yǎng)基，黑曲霉產(chǎn)孢量最高;以紅薯塊為培養(yǎng)基，酵母的產(chǎn)孢量最高。綜合考慮柑橘皮渣發(fā)酵的菌種優(yōu)化擴大培養(yǎng)條件為:以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為56 h。并進行柑橘皮渣發(fā)酵中試試驗，結(jié)果表明皮渣發(fā)酵飼料的粗蛋白、粗脂肪含量明顯提高，水分和糖類物質(zhì)含量呈下降趨勢。

柑橘皮渣，多菌種，發(fā)酵

近年來，柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢頭迅猛，產(chǎn)量顯著提高，已成為柑橘主產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)之一［1］，為促進農(nóng)村經(jīng)濟、有效改善生態(tài)環(huán)境做出了積極貢獻。世界柑橘總量的40%左右用于加工，而柑橘深加工必然產(chǎn)生大量的皮渣，約占柑橘總重的50%左右［2］。目前大量的柑橘皮渣并未得到綜合利用［3－5］。柑橘皮渣以廢棄物處理其成本日益攀升，這使得柑橘皮渣的資源化利用逐漸成為研究人員及柑橘工業(yè)關(guān)注的熱點。以前的研究表明柑橘皮渣營養(yǎng)豐富［6］，可作為動物飼料添加劑。Lo Curto等［7］將工廠產(chǎn)生的柑橘皮渣干燥后作為動物飼料。但柑橘皮渣苦味重，適口性差，蛋白質(zhì)含量不高，動物吸收低。曾虹燕等［8］的研究認為，橘皮粉作為飼料添加劑，可提高動物抗病性、增加食欲、提高日增重量等;此前的研究表明［9］，利用柑橘皮渣生產(chǎn)發(fā)酵飼料，發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量、氨基酸含量、維生素含量都得到了增加。汪釗等［10］的研究表明，利用青霉發(fā)酵柑橘皮渣其發(fā)酵后比發(fā)酵前蛋白質(zhì)含量有明顯提高。此外，柑橘皮渣飼料的營養(yǎng)水平也受到柑橘產(chǎn)地和加工因素的影響［11］。由此可見，柑橘皮渣經(jīng)過多菌種綜合發(fā)酵，既能提高飼料營養(yǎng)成分，也能改善適口性，其應(yīng)用前景非常廣闊。

本研究在以前工作的基礎(chǔ)上，利用多菌種聯(lián)合快速擴大培養(yǎng)，同時進行柑橘皮渣發(fā)酵試驗，以期為降低柑橘皮渣發(fā)酵飼料成本提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯、紅薯，購自重慶市北碚區(qū)歇馬市場;40Brix麥芽汁，中國農(nóng)業(yè)科學院柑橘研究所實驗室;柑橘皮渣(北碚447，含水分70%左右)，中國農(nóng)業(yè)科學院柑橘研究所，中試車間FMC全果榨機榨汁后皮渣;黑曲霉(2281)、康寧木霉(13016)，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;產(chǎn)朊假絲酵母(1254)，中國農(nóng)科院柑橘研究所實驗室保藏菌種。

1.2 儀器

391 FMC全國榨汁機，美國FMC公司;萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司(北京);Nichipet EX移液槍，上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司(澤泉國際集團);WAY－2S阿貝折光儀，上海精密科學儀器有限公司;PHS－3CT酸度計，上海大普儀器有限公司;立式壓力蒸汽殺菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;振蕩培養(yǎng)箱，上海博泰實驗設(shè)備有限公司;控溫多用高速組織搗碎機，江蘇江陰科研器械廠;UDK－132型半自動凱式定氮儀，意大利velp公司;MS生物顯微鏡，重慶賽奧光電有限公司。

1.3 方法

培養(yǎng)基的配置:馬鈴薯培養(yǎng)基的配制:準確稱取馬鈴薯200 g 2份并去皮，一份切成小塊，一份打漿。分別加水煮沸30 min，然后用紗布過濾。濾液加葡萄糖20g，尿素2 g，再定容至1 000mL，121℃滅菌20 min。紅薯培養(yǎng)基配制方法同上。利用阿貝折光儀測定可溶性固形物含量，各培養(yǎng)基可溶性固形物含量見表1。

表1 不同培養(yǎng)時間下各培養(yǎng)基可溶性固形物含量(0Brix)

培養(yǎng)條件:用移液管準確移取15mL，4.00Brix的麥芽汁糖溶液置入100mL的錐形瓶;并將配制好的馬鈴薯和紅薯培養(yǎng)基分別移取20mL置入100mL的錐形瓶中，設(shè)3個重復(fù)。121℃下殺菌20min。

在麥芽汁糖培養(yǎng)基中接入木霉、黑曲霉、酵母，30℃振蕩培養(yǎng)36 h，用移液槍取0.75mL麥芽汁糖培養(yǎng)物，分別接種到麥芽汁、馬鈴薯漿、馬鈴薯塊、紅薯漿、紅薯塊的液體培養(yǎng)基中，在相同的條件下分別培養(yǎng)48、56、72 h，按上述方法混合培養(yǎng)木霉、黑曲霉、酵母3種菌種，將含有3種菌種的馬鈴薯漿培養(yǎng)物依次接入到50 kg新鮮皮渣中，將30℃發(fā)酵48 h、72 h后的發(fā)酵皮渣烘干，測定其各項營養(yǎng)指標。

皮渣主要營養(yǎng)指標測定:菌數(shù)采用顯微鏡直接計數(shù)法測定［12］;水分、粗纖維、粗脂肪以及還原糖、轉(zhuǎn)化糖按國家標準分析方法測定［13］。

1.4 統(tǒng)計分析

所有測得的實驗數(shù)據(jù)都以3個重復(fù)的均值±標準差來表示。方差分析(ANOVA)通過SPSS(version 15.0.0［6 Sep 2006，SPSS Inc.］)完成，采用 Duncan多元回歸方法分析了在0.05的水平上均值的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對木霉產(chǎn)孢數(shù)量的影響

由于柑橘皮渣中含有大量的纖維素，不僅降低了飼用價值，亦降低其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，木霉具有分解纖維素的能力［14］。

由圖1可以看出，木霉以麥芽汁為培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48 h產(chǎn)孢量達到最大。當培養(yǎng)56 h后，木霉產(chǎn)孢量以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基達到最大，比麥芽汁培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量提高了13.65%，之后各培養(yǎng)基產(chǎn)孢量明顯減少。這表明以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基培養(yǎng)木霉的效果較麥芽汁有所提高，而成本卻大大降低。但隨著培養(yǎng)時間的延長，馬鈴薯漿培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量較其他幾種培養(yǎng)基下降最快，這可能與前期木霉消耗營養(yǎng)過多有關(guān)。莊敬華等［15］研究了木霉在30℃分別培養(yǎng)3、5、7d對產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)3d木霉產(chǎn)孢量即達到最大。

圖1 不同培養(yǎng)基對木霉產(chǎn)孢量的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對黑曲霉產(chǎn)孢數(shù)量的影響

從圖2可以看出，不同的培養(yǎng)基類型對黑曲霉產(chǎn)孢量有顯著影響。在30℃培養(yǎng)48 h，在紅薯塊培養(yǎng)基上黑曲霉的產(chǎn)孢量最高，其次是紅薯漿培養(yǎng)基，而馬鈴薯塊和馬鈴薯漿培養(yǎng)基上黑曲霉的產(chǎn)孢量明顯較低。但培養(yǎng)56 h后，黑曲霉的產(chǎn)孢量在紅薯塊和紅薯漿培養(yǎng)基上迅速下降，而在麥芽汁、馬鈴薯塊和馬鈴薯漿培養(yǎng)基上顯著增加，黑曲霉的產(chǎn)孢量在麥芽汁培養(yǎng)基上最高，比馬鈴薯漿培養(yǎng)基上的黑曲霉產(chǎn)孢量增加了4.65%，較以紅薯漿培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后黑曲霉產(chǎn)孢量增加了11.03%。此外，延長培養(yǎng)時間至72 h，黑曲霉的產(chǎn)孢量在各種培養(yǎng)基上均減少。由此可見，在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，在30℃培養(yǎng)56 h，盡管以麥芽汁為培養(yǎng)基黑曲霉產(chǎn)孢量最高，但從節(jié)約成本考慮，選擇以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基30℃、56 h培養(yǎng)黑曲霉最佳。

圖2 不同培養(yǎng)基對黑曲霉產(chǎn)孢量的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對酵母產(chǎn)孢量的影響

在飼料生產(chǎn)中酵母作為“單細胞蛋白”被廣泛應(yīng)用，酵母含脂肪1%～7%，無氮浸出物30%～40%。它的存在能促進機體對養(yǎng)分的吸收利用，酵母菌的代謝產(chǎn)物具有促進畜禽生長的作用，有利于家畜對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。

由表2可以看出，在30℃培養(yǎng)56 h，在各種培養(yǎng)基上酵母產(chǎn)孢量均達到最大，但酵母產(chǎn)孢量在紅薯塊培養(yǎng)基上較其他幾種培養(yǎng)基高，比麥芽汁培養(yǎng)基的酵母產(chǎn)孢量提高了5.02%。其次為紅薯漿、馬鈴薯漿和馬鈴薯塊培養(yǎng)基。延長培養(yǎng)時間至72 h，各培養(yǎng)基產(chǎn)孢量均明顯下降。為了滿足工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，從經(jīng)濟的角度綜合考慮，進行皮渣發(fā)酵飼料的優(yōu)化培養(yǎng)條件為:以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)56 h。

表2 不同培養(yǎng)基對酵母產(chǎn)孢量(1014個/mL)的影響

2.4 柑橘皮渣中試發(fā)酵試驗

為了進一步明確上述3菌種在以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基進行聯(lián)合培養(yǎng)對柑橘皮渣發(fā)酵的影響，本文通過擴大培養(yǎng)微生物試驗，對柑橘皮渣中試發(fā)酵飼料的營養(yǎng)指標進行了探討。

發(fā)酵前后培養(yǎng)基和柑橘皮渣的pH值和可溶性固形物含量見表3。由表3可知，發(fā)酵后可溶性固形物含量顯著減少。各培養(yǎng)基的pH值呈堿性，新鮮柑橘皮渣的pH值呈酸性，添加石灰使其pH值到達7，在不同的時間發(fā)酵后皮渣的pH值均呈酸性。這表明柑橘皮渣的發(fā)酵會引起乳酸發(fā)酵［16］。Cullen等［17］的研究也證明，柑橘皮渣發(fā)酵后比甜菜皮渣、玉米皮和高粱皮等產(chǎn)生更多的乳酸。因此，為了提高柑橘皮渣飼料的品質(zhì)，Migwi等［18］建議將柑橘皮渣、小麥秸稈和家禽草料按一定比例混合不僅提高飼料品質(zhì)又增強了安全性。

表3 pH值和可溶性固形物含量

由表4可以看出，柑橘皮渣發(fā)酵在48h后其粗纖維含量增加了52%，粗蛋白增加了6%;發(fā)酵72h后粗纖維含量增加了38%，而粗蛋白增加到14.69%，由于通過固態(tài)發(fā)酵，將柑橘皮渣中非蛋白的氮轉(zhuǎn)化菌體蛋白，因此經(jīng)發(fā)酵的皮渣飼料能有效的提高蛋白質(zhì)含量。粗脂肪增加不顯著，但水分和糖類物質(zhì)含量呈下降趨勢。由此可見，利用馬鈴薯作為培養(yǎng)基材料替代麥芽汁進行柑橘皮渣發(fā)酵試驗，其發(fā)酵皮渣的粗蛋白含量明顯提高，而成本大大降低。此外，飼料中粗纖維含量低，能增加牲畜的適口性，但本試驗中粗纖維并未得到有效降解，這很可能是多種菌種同時存在可能會產(chǎn)生消長作用，從而引起某一菌種的作用減弱。有研究認為［14］酵母的快速生長對黑曲霉有一定的抑制作用;而青霉的存在對木霉有效降解纖維素具有一定的協(xié)同作用。

表4 發(fā)酵前后柑橘皮渣營養(yǎng)指標

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在30℃培養(yǎng)56 h，以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基木霉產(chǎn)孢量最高;以麥芽汁為培養(yǎng)基黑曲霉產(chǎn)孢量最高;以紅薯塊為培養(yǎng)基酵母產(chǎn)孢量最高。但是，黑曲霉在麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)56 h產(chǎn)孢量比在馬鈴薯漿培養(yǎng)基僅提高了4.65%，而麥芽汁培養(yǎng)基對其他菌種并未表現(xiàn)出優(yōu)勢。綜合考慮柑橘皮渣發(fā)酵的優(yōu)化菌種培養(yǎng)條件為:以馬鈴薯漿為培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間為56h。進行皮渣發(fā)酵中試試驗，結(jié)果表明柑橘皮渣發(fā)酵飼料的粗蛋白含量明顯提高，水分和糖類物質(zhì)含量呈下降趨勢。這表明可以利用馬鈴薯漿為培養(yǎng)基替代麥芽汁培養(yǎng)基進行柑橘皮渣飼料的擴大發(fā)酵試驗，在提高柑橘皮渣發(fā)酵飼料營養(yǎng)指標的同時，大大降低了生產(chǎn)成本。此外，粗纖維并未得到有效降解。目前筆者對此正在進行進一步的研究。

［1］王川.中國柑橘生產(chǎn)與消費現(xiàn)狀分析［J］.經(jīng)濟分析，2006(1):8－12.

［2］葉興乾.柑橘加工與綜合利用［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2005:1－10.

［3］李兆龍，俞?；?柑橘綜合利用［M］.上海:上?？茖W技術(shù)文獻出版社，1997，18－25.

［4］敬璞.柑橘皮渣抗氧化作用研究［D］.重慶:西南農(nóng)業(yè)大學，2001.

［5］胡海波，張石蕊，易學武，等.柑橘渣在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究［J］.飼料工業(yè)，2006，13:49－51.

［6］Kale P N，Adsule P G，Citrus.Handbook of Fruit Science and Technology［M］.New York:Marcel Dekker，Inc:1995:39－65.

［7］Lo Curto R B，Tripodo M M，Leuzzi U，et al.Flavonoids recovery and SCP production from orange peel［J］.Bioresource Technology，1992，42:83－87.

［8］曾虹燕.利用柑橘廢料生產(chǎn)高蛋白飼料的研究［J］.湘潭大學:自然科學學報，1994(9):76－80.

［9］吳厚玖，焦必林，王華.柑橘皮渣發(fā)酵飼料中間試驗研究［J］.中國飼料，1997，17:37－39.

［10］汪釗，鄭裕國，張惠雄，等.利用柑橘加工過程中的廢物生產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵飼料［J］.環(huán)境科學研究，2002，15(1):62－64.

［11］Bampidis V A，Robinson P H.Citrus by-products as ruminant feeds:A review ［J］.Animal Feed Science and Technology，2006，128:175－217.

［12］沈萍.微生物學實驗 (第三版)［M］.北京:高等教育出版社，1999:90－91.

［13］寧正祥.食品成分分析手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998:2－4.

［14］羅建成，臧晉.多菌體共發(fā)酵作物秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2008(3):27－40.

［15］莊敬華，高增貴，劉限，等.不同發(fā)酵條件對木霉產(chǎn)孢類型的影響［J］.中國生物防治，2005，21(1):37－40.

［16］Megías M D，Martínez-Teruel A，Gallego J A，et al.Chemical changes during the ensiling of orange peel［J］.Anim Feed Sci Technol，1993，43:269－274.

［17］Cullen A J，Harmon D L，Nagaraja T G.In vitro fermentation of sugars，grains，and by-product feeds in relation to initiation of ruminal lactate production［J］.J Dairy Sci.1986，69:2 616－2 621.

［18］Migwi P K，Gallagher J R，Van Barneveld R J.The nutritive value of citrus pulp ensiled with wheat straw and poultry litter for sheep［J］.Aust J Exp Agric，2001，41:1 143－1 148.

Discuss on Optimum Culture Conditions of Multi-microorganisms for Producing Citrus Pomace Feed

Ma Ya-qin，Wang Hua，Wu Hou-jiu，Sun Zhi-gao，Huang Xue-gen，Guo Li
(National Citrus Engineering Research Center，Citrus Research Institute.Chinese Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China)

The wort medium as one of most common medium is not suitable for industrialization on a large scale due to high cost.Aiming at reducing cost，this paper takes wort medium，potato，sweet potato as raw materials to screen the optimum culture medium and conditions for viridin，black mold，Candida tropicalis.The results showed that at 30℃ for 56h，the yields of spores produced by viridian reached its peak when using thick liquid potato medium，that by black mold using wort medium，and that by Candida tropicalis using sweet potato piece medium.The optimum culture conditions of multi－microorganisms for producing citrus pomace feed were determined as:thick liquid potato medium，30℃ of culture temperature and 56h of culture time.Furthermore，the pilot experiment for fermenting citrus peel was studied.The results showed that the contents of crude fiber，crude protein and crude fat increased after the fermentation while the contents of water and sugar decreased obviously.

citrus pomace，microorganism，fermentation

博士，副研究員(王華為通訊作者)。

*現(xiàn)代柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系橙汁加工崗位部分研究內(nèi)容;“十一五”國家科技支撐計劃(2007BAD47B06)

2010－06－18，改回日期:2010－09－15