栗 娜 周劍章 林玲玲 韓楠楠 林仲華

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,固體表面物理化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361005)

金納米粒子比色測定細(xì)胞色素c構(gòu)象變化

栗 娜 周劍章*林玲玲 韓楠楠 林仲華

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系,固體表面物理化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建廈門 361005)

金納米粒子(Au NPs)的顏色會(huì)隨著細(xì)胞色素c(Cyt c)構(gòu)象變化而發(fā)生較大的變化,作者在改變原測定流程的基礎(chǔ)上利用這種有規(guī)律的變化研究和測定了H+和L-半胱氨酸(L-Cys)對(duì)Cyt c的構(gòu)象變化.實(shí)驗(yàn)中分別加入pH=1-13的Cyt c,可以使Au NPs顯示青、藍(lán)、紫、紅等明顯不同的顏色,從而可以利用Au NPs比色快速測定不同pH值的Cyt c構(gòu)象變化.在pH=7時(shí),當(dāng)附加L-Cys濃度從低濃度變化到高濃度時(shí),Au NPs顏色逐漸從紫色變化到藍(lán)色、青色,從而實(shí)現(xiàn)利用Au NPs比色測定由L-Cys所引起Cyt c構(gòu)象變化.圓二色(CD)光譜證實(shí)了pH=1-13和不同濃度L-Cys下的Cyt c構(gòu)象變化.借助紫外-可見吸收光譜和掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)一步明確了加入Cyt c后Au NPs的不同聚集狀態(tài)與其顏色變化的關(guān)系.

Au納米粒子; 比色測定;Cyt c構(gòu)象變化;pH值;L-Cys

自從1996年Mirkin等[1]首次構(gòu)筑了脫氧核糖核酸(DNA)-金納米粒子(Au NPs)生物納米復(fù)合體系以來,近年利用Au NPs作為光學(xué)生物傳感器成為研究熱點(diǎn)[2-4].鑒于其不同聚集狀態(tài)時(shí)顏色不同,Au NPs比色測定已經(jīng)廣泛應(yīng)用在金屬離子[5-7]、DNA[8-9]、酶[10-12]、蛋白質(zhì)[13-14]的檢測和作用原理研究中.細(xì)胞色素c(Cyt c)是中心為血紅素結(jié)構(gòu)的低分子量蛋白,在細(xì)胞呼吸鏈中擔(dān)負(fù)著傳遞電子的重要作用.在不同條件(如pH值、溫度及氧化還原性物質(zhì)共存)下, Cyt c有著不同的構(gòu)象[15].研究Cyt c的構(gòu)象變化對(duì)于理解其構(gòu)象和其在生物分子中的功能之間的關(guān)系有著至關(guān)重要的作用.Zare等[16]利用Au NPs比色測定了不同pH時(shí)酵母菌細(xì)胞色素c(Cyt c)的構(gòu)象變化,這也是第一次利用Au NPs比色測定蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化.而Francoet等[17]分別研究了酵母菌和馬心Cyt c在Cyt c-Au NPs復(fù)合體系中的表面性質(zhì).

然而，之前的研究需要先制備穩(wěn)定的Cyt c-Au NPs復(fù)合體系(要過夜)，再調(diào)節(jié)復(fù)合體系pH值[16-17].作為一種檢測方法而言，這樣的操作過程還是比較繁瑣、耗時(shí).我們利用蛋白質(zhì)構(gòu)象變化延遲性的特點(diǎn)[18],改變了測定流程.先將Cyt c調(diào)節(jié)到各個(gè)pH值,后加入到Au NPs中,雖然加入Au NPs后體系的最終pH值會(huì)改變,但是Cyt c構(gòu)象短時(shí)間內(nèi)變化很小.由此得到了一種利用Au NPs更簡單,更快速(1 min內(nèi)變色),pH值范圍更廣泛(pH為1-13,之前pH為4-11),顏色變化更多樣的檢測H+引起的馬心Cyt c構(gòu)象變化的方法.接著,我們又利用Au NPs比色成功測定了在pH=7的條件下由L-半胱氨酸(LCys)引起的馬心Cyt c構(gòu)象變化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸HAuCl4·4H2O和檸檬酸三鈉Na3C6H5O· 2H2O購自北京化學(xué)制藥廠,分析純;L-半胱氨酸(LCys)鹽酸鹽C3H8ClNO2S購自吉爾生化有限公司,分析純;三羥甲基氨基甲烷(Tris)氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉均購自國藥集團(tuán)分析試劑有限公司,分析純;馬心細(xì)胞色素c(Cyt c氧化型)購自Sigma Chemical Co.,分析純,未經(jīng)任何處理,溶解在緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris+10 m mol·L-1NaCl,pH=7)中以制備500 mg·L-1儲(chǔ)備液.0.1 mol·L-1L-Cys儲(chǔ)備液的制備是將適量的L-Cys鹽酸鹽加入緩沖溶液中,用NaOH調(diào)節(jié)至 pH=7.實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水(Milli-Q,Millipore).

照片由日本佳能IXUS 970 IS型數(shù)碼相機(jī)拍攝, pH值由美國奧立龍828精密型酸度計(jì)測量得到.紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜由日本島津公司 UV-2100雙池紫外-可見吸收光譜儀測量,以超純水作為參比溶液.圓二色(CD)光譜是由日本分光株式會(huì)社J-810圓二色譜儀測量.掃描電子顯微鏡(SEM)圖是由日本日立公司Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡測試得到.所有實(shí)驗(yàn)測試均在常溫下進(jìn)行.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

Au NPs的制備:利用文獻(xiàn)方法[19]合成,在250 mL錐形瓶中分別加入150 mL超純水,將1.815 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸溶液回流加熱煮沸后,加入4.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液回流加熱至變?yōu)闇\紫色后繼續(xù)回流加熱50 min,最終顏色為鮮紅色.冷卻至室溫后,存儲(chǔ)在冰箱(4℃),待用.

H+引起的Cyt c構(gòu)象變化的比色測定及表征:首先用緩沖液稀釋Cyt c儲(chǔ)備液到50 mg·L-1,用HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)pH值到1-6和7-13,將制備好的樣品進(jìn)行CD光譜測試.然后將15 μL不同pH值的Cyt c加入400 μL Au NPs中,迅速混勻后觀察其顏色變化(1 min之內(nèi)變色)并拍照,后直接用于UV-Vis吸收光譜檢測.滴加含有Cyt c的Au NPs溶液到硅片上,1 min后,用濾紙吸干,并用超純水洗凈,靜置放干,用于SEM圖測試.

L-Cys引起的Cyt c構(gòu)象變化的比色測定及表征:首先利用L-Cys儲(chǔ)備液和Cyt c儲(chǔ)備液制備含L-Cys的Cyt c,其中Cyt c濃度為50 mg·L-1,而LCys濃度分別為 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.50 mmol·L-1,用于CD光譜測試.將15 μL不同濃度L-Cys的Cyt c加入400 μL Au NPs中,迅速混勻,觀察其顏色變化并拍照.同上處理后用于UV-Vis吸收光譜和SEM測試.

2 結(jié)果與討論

2.1 Au NPs的制備與表征

圖1的內(nèi)插圖A為Au NPs的SEM圖,可看出所制備Au NPs呈規(guī)則的球形,分散性很好.圖1中UV-Vis吸收光譜圖表明其最大吸收峰在 521 nm處,特征吸收峰尖銳.所制備的Au NPs顏色鮮紅,相當(dāng)穩(wěn)定(見圖1內(nèi)插圖B).

2.2 Au NPs比色測定不同pH值下Cyt c的構(gòu)象變化

圖2展示了不同pH值下不含和含Cyt c的Au NPs的照片.上面一列是在Au NPs中分別加入單純緩沖液(pH從1到13)的照片,可以看到Au NPs顯示紅色,說明Au NPs在此酸堿性條件下很穩(wěn)定,這與文獻(xiàn)的結(jié)果[16]一致.而下面一列是含Cyt c的Au NPs照片,可以看到加入不同pH值的Cyt c后,Au NPs逐漸顯示從青色到藍(lán)色,再到紫色,最后為紅色.Cyt c的pH=1時(shí),呈現(xiàn)青色;pH=2時(shí),呈現(xiàn)深藍(lán)色;pH=3-7,呈現(xiàn)藍(lán)色;pH=8-10,呈現(xiàn)紫色;pH= 11-13時(shí)候,呈現(xiàn)紅色.

圖1 Au納米粒子(NPs)的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of Au nanoparticles(NPs)Insets are SEM image(A)and the photo(B)of Au NPs.

這些不同顏色體現(xiàn)了Au NPs不同的聚集狀態(tài),藍(lán)(青)色為深度聚集狀態(tài),紫色為輕度聚集狀態(tài),而紅色則是分散狀態(tài).圖3的SEM圖展示了分別加入pH值為1、4、7、11的Cyt c后Au NPs的形貌.由圖可見:pH=1時(shí),Au NPs聚集程度最強(qiáng);pH=4,7時(shí),聚集程度較弱;而pH=11時(shí),Au NPs則處于分散狀態(tài),這與其相應(yīng)的顏色變化保持著高度的一致性.

圖4(A)是加入不同pH值的Cyt c后Au NPs的UV-Vis吸收光譜(由于溶液中Cyt c的最終濃度很低,其UV-Vis吸收峰被Au NPs的吸收峰所掩蓋).當(dāng)加入pH值從1到10的Cyt c時(shí),Au NPs第二等離子共振吸收峰(金納米粒子聚集后由于相鄰粒子間的等離子共振偶合而出現(xiàn)相對(duì)520 nm紅移的新的等離子共振吸收峰)的峰位對(duì)應(yīng)的波長逐漸從623 nm減小到577 nm,而加入pH值從11到13的Cyt c時(shí),Au NPs沒有第二等離子共振吸收峰,只有其521 nm處的特征吸收峰.可以看出,pH=1-10時(shí),吸收峰峰位變化較大;而pH=11-13時(shí),對(duì)應(yīng)峰位波長基本不變.為了進(jìn)一步比較Au NPs等離子共振吸收峰位與pH值的關(guān)系,我們做了該峰位下波長與pH值的關(guān)系曲線(見圖4(A)的內(nèi)插圖).可以看出,pH從1到10變化時(shí),峰位波長隨著pH值的變大而逐漸減小,而pH從11到13時(shí),峰位變化很小,基本趨于不變.這跟其顏色從pH=1-10顯示聚集態(tài)的青、藍(lán)、紫色,而pH=11-13顯示分散態(tài)的紅色是很一致的.

圖2 不含(上列)和含(下列)Cyt c的Au NPs照片F(xiàn)ig.2 Photos of Au NPs without(upper)and with(lower)Cyt cpH:1-13

圖3 含pH值分別為1,4,7,11的Cyt c的Au NPs的SEM圖Fig.3 SEM images of Au NPs with Cyt c for pH=1,4,7,11

圖4 含Cyt c的Au NPs的UV-Vis吸收光譜(A)和Cyt c的圓二色光譜(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra of Au NPs with Cyt c(A)and CD spectra of Cyt c(B)Inset:the plot between wavelengths at absorption peaks with different pH values.The arrowhead points pH values from 2 to 10.

由于馬心Cyt c主要是通過靜電吸附在Au NPs上[17],所以當(dāng)Cyt c的pH值低于其等電點(diǎn)(10-10.8)時(shí),帶負(fù)電的Au NPs與帶正電的Cyt c相互吸引,從而Au NPs呈現(xiàn)聚集狀態(tài),表現(xiàn)出紫色或者藍(lán)(青)色;相反,當(dāng)Cyt c的pH高于其等電點(diǎn)時(shí),帶負(fù)電的Au NPs與帶負(fù)電的Cyt c相互排斥,從而Au NPs呈現(xiàn)分散狀態(tài),表現(xiàn)為紅色.同時(shí),在不同pH值下, Cyt c構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化.pH=0.42-2.5時(shí),Cyt c的疏水內(nèi)核打開,其為非折疊蛋白;pH=2.5-12.76時(shí), Cyt c是折疊蛋白;而高于12.76時(shí)為另一種非折疊蛋白[15].本實(shí)驗(yàn)中是先將Cyt c調(diào)節(jié)到各個(gè)pH(模擬各實(shí)際情況)后加入到Au NPs中,雖然加入Au NPs后體系最終的pH值會(huì)改變,但是Cyt c構(gòu)象短時(shí)間內(nèi)變化很小.我們的CD光譜實(shí)驗(yàn)證實(shí),加入Au NPs后,在實(shí)驗(yàn)測試時(shí)間內(nèi),Cyt c的構(gòu)象基本保持不變.圖4(B)是pH=1-13 Cyt c的CD光譜,其中208和222 nm兩處負(fù)峰是Cyt c的α高螺旋結(jié)構(gòu)特征峰[20].在pH=3-12時(shí),222和208 nm處存在負(fù)峰,說明Cyt c的α螺旋結(jié)構(gòu)保持,Cyt c為折疊蛋白;而pH=1-2以及pH=13時(shí),兩個(gè)負(fù)峰消失,此時(shí)Cyt c處于兩種不同結(jié)構(gòu)的非折疊狀態(tài).當(dāng)Cyt c為pH＜2.5(pH=2,1)的非折疊蛋白構(gòu)象時(shí),Cyt c帶正電,Au NPs呈現(xiàn)深藍(lán)色和青色;pH低于其等電點(diǎn)(pH=3-10)的折疊蛋白構(gòu)象時(shí),Cyt c也帶正電,Au NPs呈現(xiàn)藍(lán)色和紫色;pH高于其等電點(diǎn)(pH=11-12)的折疊蛋白構(gòu)象時(shí),Cyt c帶負(fù)電,Au NPs顯示紅色,可見等電點(diǎn)前后變色尤其明顯;而pH=13的非折疊蛋白構(gòu)象時(shí),Cyt c也帶負(fù)電,Au NPs也顯示紅色.由此可見,我們可以利用Au NPs比色快速靈敏地測定pH=1-13時(shí)Cyt c的構(gòu)象變化.

2.3 Au NPs比色測定L-cys引起的Cyt c構(gòu)象變化

已有研究發(fā)現(xiàn)，Cyt c電化學(xué)研究中所采用的有些促進(jìn)劑(如碘離子[21]、胱氨酸[22])可能會(huì)與Cyt c表面的賴氨酸作用進(jìn)而引起Cyt c分子的構(gòu)象發(fā)生微小的變化.L-Cys也是一種Cyt c電化學(xué)活性的促進(jìn)劑,同時(shí)Cyt c中血紅素能以共價(jià)鍵與蛋白鏈中的L-Cys相聯(lián)[15],而L-Cys與Cyt c相互作用是否也會(huì)引起Cyt c構(gòu)象的變化尚未見報(bào)道.我們嘗試通過Au NPs比色測定與L-Cys相互作用后Cyt c構(gòu)象可能出現(xiàn)的微小變化，并用CD光譜進(jìn)行驗(yàn)證.圖5(A)的插圖是含不同濃度L-Cys的Cyt c加入Au NPs中后的照片,由圖可見,在無L-Cys時(shí),Au NPs為紫色;低濃度L-Cys時(shí),Au NPs為深紫色、藍(lán)色;而高濃度L-Cys時(shí),Au NPs為青色.圖5(A)是相應(yīng)的UVVis吸收光譜,可見,L-Cys濃度逐漸增大時(shí),Au NPs第二等離子共振吸收峰峰位逐漸從短波長(560 nm)向長波長(664 nm)移動(dòng).從圖5(B)對(duì)應(yīng)不同濃度LCys時(shí)Cyt c的CD光譜中可見,隨著L-Cys濃度增加,222和208 nm處峰值逐漸增大,據(jù)此可推測Cyt c的α螺旋隨之逐漸加強(qiáng),在不含Cyt c的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中,單純L-Cys并不能引起Au NPs顏色變化.所以外加L-Cys所引起的Au NPs的顏色變化及UV-Vis吸收光譜的變化應(yīng)來源于Cyt c的構(gòu)象變化.我們認(rèn)為,外加L-Cys和原來Cyt c中蛋白鏈上的L-Cys會(huì)競爭與血紅素作用,這種競爭作用致使Cyt c發(fā)生上述構(gòu)象變化,從而進(jìn)一步導(dǎo)致Au NPs顯色逐漸加深.

圖5 含Cyt c和L-Cys的Au NPs的UV-Vis吸收光譜(A)和含不同濃度L-Cys的Cyt c的CD光譜(B)Fig.5 UV-Vis absorption spectra of Au NPs with Cyt c and L-Cys(A)and CD spectra of Cyt cwith different concentrations of L-Cys(B)Inset:photographs of Au NPs.From left to right,the concentrations of the L-Cys are 0.00,0.15,0.20,0.25,0.30,0.50 mmol·L-1,respectively.

3 結(jié) 論

根據(jù)Cyt c構(gòu)象變化能夠引起Au NPs的聚集狀態(tài)變化從而變色這一特性,在改變原測定流程的基礎(chǔ)上利用Au NPs比色測定了由H+和L-Cys引起的Cyt c的構(gòu)象變化.加入pH值分別從1到13的Cyt c可以導(dǎo)致Au NPs分別顯示青、藍(lán)、紫、紅等顏色;同時(shí)pH=7時(shí),當(dāng)外加L-Cys從低濃度逐漸變化到高濃度引起Au NPs顏色逐漸從紫色變化到藍(lán)色、青色.CD光譜證實(shí)了不同濃度H+和L-Cys下Cyt c的構(gòu)象變化,同時(shí)UV-Vis吸收光譜中第二等離子共振吸收峰的移動(dòng)和SEM圖進(jìn)一步明確了加入不同構(gòu)象的Cyt c后Au NPs聚集狀態(tài)的變化.結(jié)果表明,可以利用Au NPs比色測定的方法簡單、快速地檢測其他離子或分子與Cyt c的相互作用所引起的Cyt c構(gòu)象的變化.

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Au Nanoparticles Based Colorimetric Detection of Conformational Changes in Cytochrome c

LI Na ZHOU Jian-Zhang*LIN Ling-Ling HAN Nan-Nan LIN Zhong-Hua
(Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surface,Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemistry Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,Fujian Province,P.R.China)

The colors of Au nanoparticles(Au NPs)change along with conformational changes in cytochrome c(Cyt c). We exploited this property for the colorimetric detection of Cyt c conformational changes induced by H+and L-cysteine(L-Cys).We improved the conventional procedure for this detection.After the addition of Cyt c within different pH values,the Au NPs are either cyan,blue,purple or red.This indicates that the Au NPs can be applied to the rapid colorimetric detection of pH-induced conformational changes in Cyt c.At pH 7 the color of Au NPs changes from purple to blue and then cyan upon the addition of L-Cys,which suggests that the Au NPs can be used for the colorimetric detection of Cyt c conformational changes caused by interaction with L-Cys.The conformational changes of Cyt c were verified by circular dichroism(CD)spectroscopy.The relationship between the aggregation states and colors of the Au NPs after the addition of Cyt c was characterized by UV-Vis absorption spectroscopy and scanning electron microscopy(SEM).

Au nanoparticle;Colorimetric detection;Conformational changes of Cyt c;pH value;L-Cys

O648

Received:March 8,2010;Revised:April 22,2010;Published on Web:July 16,2010.

*Corresponding author.Email:jzzhou@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2189663.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20603027,20423002).

國家自然科學(xué)基金(20603027,20423002)資助項(xiàng)目

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