劉海波 崔 巍 徐 峻 彭 勇,* 周家駒 肖培根

(1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所,北京 100193; 2中國科學院研究生院化學與化學工程學院,北京 100049; 3中山大學藥學院,廣州 510275;4中國科學院過程工程研究所,北京 100190)

中藥活性成分對血栓素A2受體抑制作用的分子模擬

劉海波1崔 巍2徐 峻3,*彭 勇1,*周家駒4肖培根1

(1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所,北京 100193;2中國科學院研究生院化學與化學工程學院,北京 100049;3中山大學藥學院,廣州 510275;4中國科學院過程工程研究所,北京 100190)

中藥中黃酮類化合物和白藜蘆醇等活性成分對血栓素A2受體具有抑制作用,但具體機理不詳.本研究通過同源模建方法,以墨魚視紫紅質蛋白為模板,構建血栓素A2受體的蛋白質結構模型.并使用分子對接方法研究中藥活性成分白藜蘆醇和芹菜苷元與血栓素A2受體模型的作用方式,據此建立藥效團模型,篩選其他潛在的血栓素A2受體抑制劑.結果表明:白藜蘆醇等中藥活性成分能與血栓素A2受體活性口袋中的殘基發(fā)生氫鍵作用,結合方式與血栓素相似.血栓素與Ser201、Leu198、Arg295和Thr298發(fā)生氫鍵作用,白藜蘆醇等活性成分與Ser201、Leu198和Arg295發(fā)生氫鍵作用.建立的藥效團模型由7個藥效元素以及排斥性空間元素組成,經測試對高活性的血栓素A2受體抑制劑有比較好的選擇性.使用該藥效團模型對中藥天然產物數據庫進行篩選,命中了一批可能具有血栓素A2受體抑制作用的活性化合物.其中一些已經報道有抑制血小板凝聚活性.本研究表明血栓素A2受體可能是活血化瘀類中藥的一個潛在的靶點.

中藥; 藥物靶標; 血栓素受體; 活血

血栓素A2(thromboxane A2,TXA2)是花生四烯酸代謝通路的產物之一,由前列腺素H2(prostaglandin H2,PGH2)在TXA2合成酶(thromboxane A2 synthase, TBXAS)的作用下發(fā)生異構化生成,該反應主要發(fā)生在血小板中.TXA2結構不穩(wěn)定,很快水解成為血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)(圖1),半衰期只有30 s[1].TXA2是與血小板聚集相關的重要內源性激素,通過作用于血栓素A2受體(thromboxane A2 receptors,TP)促進血小板凝集.PGH2也有類似活性,而水解產物TXB2沒有該作用[2].

自從上個世紀70年代被發(fā)現以來,TXA2一直是心血管藥物開發(fā)的重要研究對象[3].前期研究重點放在對TBXAS抑制劑的開發(fā)上,后來發(fā)現由于TXA2前體PGH2也能促進血小板聚集,因此單純抑制TBXAS活性并不能降低血栓形成.90年代以后,研究重點轉向了TXA2/PGH2共同受體抑制劑,以及TBXAS和TP雙抑制劑的開發(fā)上[4-5].已經證實TP抑制劑可以有效降低TXA2和PGH2的血小板聚集和血管收縮作用[6].

TP屬于G蛋白偶聯受體超家族(G-protein-coupled receptor,GPCR).GPCR在化學藥物的研發(fā)中占有重要地位,GPCR為靶標的藥物占有很高的市場份額[7].該家族一級序列相似性不高,但具有高度的結構相似性,每個受體都是單亞基膜蛋白,由7個α螺旋跨膜區(qū)(transmembrane,TM),3個外袢(extracellular loop,eLP),3個內袢(cytoplasmic loop,cLP),1個細胞外N末端和1個膜內C末端構成[8].

TP的蛋白質結構研究有較長的歷史[9],但到目前為止還沒能通過實驗方法獲得蛋白質晶體.Ruan等[10-11]使用核磁共振方法得到了eLP2和eLP3在溶液中的構象,并據此通過分子模擬軟件,構建了TP與小分子結合的活性口袋[12].TXA2與TP作用方式的研究一般使用與TXA2結構相似的不易水解的化合物[9,13],通過突變、光親合標記和特異位點抗體等方法尋找與配體發(fā)生作用的關鍵殘基[14-15].

中藥中的黃酮類化合物[16]和白藜蘆醇[17-19]被報道對TP有抑制作用,但是分子作用機制仍不清楚.由于這兩類化合物有共同結構特征,因此很可能與TP有相似的作用方式.本研究擬通過同源建模方法構建TP的蛋白質結構,使用分子對接方法研究TXA2與TP的作用機制,之后進一步研究黃酮類化合物和白藜蘆醇對TP抑制作用的機理,據此建立藥效團模型,在中藥天然化合物中尋找其他可能的TP抑制劑.

1 數據和方法

1.1 TP結構同源建模

1.1.1 軟件和算法

同源建模工作在靶分子信息學平臺(target informatics platform,TIP)上完成.該平臺是由Eidogen-Sertanty公司開發(fā)的結構信息知識庫[20],包括了來自SWISS-PROT和IPI(international protein index)的人、小鼠、大鼠的序列數據,以及PDB(protein data bank)數據庫中晶體結構數據.目前共有超過75000個人類蛋白結構(包括已經發(fā)表的晶體模型和使用STRUCTFAST建立的模型)和超過125000的活性位點信息.

圖1 血栓素A2(TXA2)代謝反應Fig.1 Metabolic reactions of thromboxane A2(TXA2)TBXAS:thromboxane A2 synthase

STRUCTFAST(structure realization utilizing cogent tips from aligned structural templates)是TIP特有的用于蛋白質同源建模的一種算法.該算法利用一種新的動力學程序引擎,將同族蛋白結構特征信息結合到比對過程中,能夠篩選蛋白質序列間的弱的相似性.有研究證明,STRUCTFAST和專家同源建模的結果相當或者更好[21].由于TP所屬的GPCR家族具有序列一致性低,結構相似性高的特點,因此更適合使用STRUCTFAST進行建模.

1.1.2 操作及模板選擇

TIP平臺每次收錄新的蛋白質序列后,會計算該序列與目前所有的蛋白質晶體結構的序列一致性,尋找最合適的模板進行同源建模.登錄TIP平臺,使用TP受體序列P21731-2(SWISS-PROT編號)建立同源模型TP model,使用的模板為墨魚視紫紅質蛋白(PDB編號:2z73)[22-23]的A鏈,序列一致性為15%,該模板也屬于GPCR家族.

1.1.3 動力學優(yōu)化

應用AMBER03力場參數處理蛋白質分子,并應用gaff力場處理配體分子,配體分子電荷使用Gaussian 03[24]計算,應用靜電勢收斂算法,在分子力學優(yōu)化的結構上進行單點計算以確定各原子上的電荷.分子動力學模擬計算以AMBER 10軟件[25]運行,應用tleap程序添加缺失的氫原子,體系以削角正八面體的TIP3P水周期盒子包裹,根據體系靜電勢分布,在正電勢最集中區(qū)域加入7個Cl-離子使體系總電荷平衡.

首先對體系進行能量優(yōu)化,能量優(yōu)化分三步進行:第一步約束蛋白質和配體分子中的重原子,優(yōu)化全部溶劑分子和溶質分子中的氫原子;第二步約束蛋白質骨架重原子,優(yōu)化全部側鏈原子和氫;第三步自由優(yōu)化全部原子.優(yōu)化結束后,開始進行分子動力學模擬,首先在60 ps時間中分7步應用溫度耦合算法將體系從0 K升溫至310 K,隨后在310 K進行穩(wěn)態(tài)模擬,應用shake算法穩(wěn)定含氫化學鍵,應用PME算法處理長程靜電相互作用,動力學模擬步長選為2 fs,每隔0.2 ps輸出一次軌跡構象和體系能量等信息.最終運行了6 ns模擬,從軌跡中選取勢能穩(wěn)定階段的平均構象作為分子動力學優(yōu)化結果.

1.2 TXA2的分子對接及結合模式分析

用molecular operating environment(MOE)[26]進行配體-受體對接研究,步驟如下:(1)將由TIP建立的模型導入MOE,根據TP結構的相關實驗研究結果進行相應調整,使用AMBER99力場進行能量優(yōu)化;(2)導入TXA2分子,使用MMFF94x力場進行構象能量優(yōu)化;(3)以模板蛋白中的配體分子視黃醛(retinal)為小分子模板,使用 MOE中的 flexible alignment模塊將TXA2與之進行疊合,產生一個疊合構象庫,從中根據經驗選擇最合理的幾個構象作為TXA2在TP中的初始構象;(4)選取TXA2分子和受體活性口袋中0.8 nm范圍內的氨基酸殘基,其余部分固定,使用MMFF94x力場進行能量優(yōu)化; (5)使用potential energy模塊計算結合自由能,使用ligand interactions分析活性小分子與活性口袋中殘基間的相互作用;(6)取疊合構象庫中TXA2的其他構象,重復步驟4、5,將結果與實驗研究進行比較,最終確定最合理的結合模式.

1.3 黃酮和白藜蘆醇對TP抑制的分子對接研究

基本步驟與1.2相同,黃酮類化合物選擇活性最高的芹菜苷元(apigenin)作為研究對象[16],芹菜苷元和白藜蘆醇的初始位置和構象參考1.2節(jié)得到的模型中TXA2的結合方式.

1.4 TP抑制劑藥效團模型的建立及數據庫篩選

1.4.1 ATCMD數據庫及3D構象庫的建立

ATCMD(annotated traditional Chinese medicine database)是根據《中藥原植物化學成分集》[27]中的數據建立的小分子庫.該書收集整理了中外科學家發(fā)表的5507篇(部)文獻中的中藥成分化合物23033個,涉及藥用植物6760種,其中7819種化合物有藥理實驗數據.該數據庫的化合物結構非常精準可靠,藥理數據也比較豐富,因此本研究采用該數據庫作為藥效團篩選對象.首先將數據庫中全部化學結構導出到sdf文件,之后使用德國Mol-Net公司Corina軟件[28]生成低能構象庫,每個分子除了生成最低能量構象外,還在最低能量構象以上84 kJ·mol-1范圍內保留最多20個低能構象.原數據庫23033個分子共生成255879個構象結構,構象庫使用MOE database管理.

1.4.2 建立抑制劑藥效團模型

使用MOE的Ph4 query editor模塊建立藥效團模型.由于MOE在藥效團建立過程中不考慮小分子的生物活性,側重于尋找小分子間三維結構的相似性,所建立的藥效團模型比較類似于目前流行的藥效團軟件CATALYST[29]建立的common features hypotheses.這種算法比較適合于在配體小分子數量比較少或者缺少充足的活性數據的情況下建立藥效團模型.MOE在建立藥效團的過程中能加入受體口袋的空間因素,因此所建立的藥效團模型可以快速篩選到體積適合,并且具有相似三維構象的分子,但不能對生物活性進行預測.

具體步驟如下:(1)從1.3節(jié)建立的模型中分離出芹菜苷元和白藜蘆醇分子,保持構象疊合在一起; (2)在 Ph4 query editor中設定 PCHD(polaritycharge-hydrophobicity-direction)藥效元素組合,使用Consen-sus tool枚舉出所有可能的藥效團元素;(3)結合1.3節(jié)中小分子與TP相互作用模式及相關實驗研究結果,選擇藥效團元素組合方式,并對每個元素的體積等條件進行調整;(4)選擇TP活性口袋中與配體小分子距離0.6 nm范圍內的氨基酸殘基,據此建立排除體積(excluded volume)模型.

為了考查建立藥效團模型的選擇效率,建立了一個測試數據集.根據文獻報道[16],收集了20種黃酮類化合物,對TP的抑制率在0%-64%之間.使用與1.4.1節(jié)中相同的方法建立測試分子3D結構數據庫,使用建立的模型對數據庫進行藥效團篩選,根據命中分子的情況調整藥效元素直到確定最好的藥效團模型.

1.4.3 3D分子庫的藥效團篩選

在MOE database的Ph4 database search模塊中使用1.4.2節(jié)中生成的藥效團模型對ATCMD構象庫進行篩選,對命中的天然產物的化學結構類型和藥理活性進行分析整理.

2 結果與討論

2.1 TP同源建模結果

Ramachandran圖是蛋白質主鏈的ψ-φ角度分布圖,是蛋白質構象合理性的一種直觀的表述.如果高能角出現頻率過高,則說明該構象不合理或者與實際構象差別比較大.MOE的protein geometry模塊能對蛋白質構象生成四種Ramachandran圖[30],分別對應于一般氨基酸,甘氨酸,脯氨酸和前脯氨酸(pre-proline),多數高能角出現在一般氨基酸圖中.對經過能量優(yōu)化的同源建模模型TP model及其模板2z73A作Ramachandran圖(圖2).可以看到,模板蛋白質只有一個高能角,TP model在一般氨基酸圖中有9個高能角,只占總數的2.7%,主要分布在內袢和外袢區(qū),7個過膜區(qū)沒有高能角,可以認為由TIP建立的模型基本上是合理的.

由TIP模型為基礎進行動力學模擬,結果顯示體系的勢能在500 ps內達到穩(wěn)態(tài)狀態(tài).均方根偏差(RMSD)1000 ps后也基本達到平衡狀態(tài)(圖3).對最終得到的平均能量構象進行穩(wěn)定性分析,發(fā)現高能角的數量由9個降低到3個(圖2),說明模型已經得到了優(yōu)化,非常穩(wěn)定,可以進行下面的分子對接研究.

2.2 TXA2對接結果

TXA2與TP的對接結果顯示(圖4),TXA2與TP的結合部位位于第三外袢以下,7個過膜螺旋之間的部位,分子的羧基端與Arg295形成兩個氫鍵,與Thr298形成一個氫鍵,羥基端與Ser201和Leu198形成一個氫鍵.結合自由能也比較大,達到-633.14kJ·mol-1,TXA2與TP間的靜電作用為主要作用力(表1).

圖2 同源建模模型和模板的蛋白質構象以及Ramachandran圖Fig.2 Conformation and Ramachandran plots of homology model and templateTIP:target information platform,MD:molecular dynamics

文獻中TXA2與TP結合模式的實驗研究結果主要有:(1)TXA2類似物和受體特異性拮抗作用發(fā)現,TP的配體結合部位為TM5的Ser201與TM7的Arg295之間的一個疏水性口袋[31],從圖4a可以看到對接模型與該實驗結果吻合;(2)TXA2及其類似物的羧基與Arg295,羥基與Ser201發(fā)生氫鍵作用,而分子中央的疏水性部分位于受體的疏水性口袋中[31],從圖4b看,模型與實驗吻合;(3)Turek等[14]用光親合標記法和特異位點抗體法研究發(fā)現,第三外袢Cys183到Asp193是直接參與TP和配體結合的氨基酸序列,從圖4c看,模型中TXA2正位于eLP3的Cys183到Asp193的部分之下,與該段肽鏈有緊密的作用,與實驗吻合;(4)Ruan等[13]使用PGH2相似分子進行對接研究發(fā)現,TP和配體結合時,配體的兩條臂充分打開,羧基一端盡量伸展,羥基一端在羥基以外的碳鏈向回折,形成一種長方形的形式與TP結合,從圖4d看,模型中的TXA2分子的構象與實驗基本吻合.

表1 分子對接的結合自由能Table 1 Binding free energy obtained from docking results

圖5 芹菜苷元和白藜蘆醇與TP受體間的對接結果Fig.5 Docking results for the apigenin,resveratrol and TP(a)hydrogen bond interaction;(b)docking result

綜上所述,本研究得到的對接模型與上面四個實驗結果都保持一致,因此認為這種結合方式比較符合實際情況.

2.3 芹菜苷元和白藜蘆醇的分子對接結果

結果顯示,芹菜苷元和白藜蘆醇以相同的方式結合到 TP活性口袋里,與 Ser201、Leu198和Arg295發(fā)生氫鍵作用(圖5).這種作用方式與TXA2相似,不同之處在于沒有與Thr298產生氫鍵的作用.從結合自由能看,白藜蘆醇的結合強度比較大,芹菜苷元較弱(表1).

圖6 芹菜苷元和白藜蘆醇的藥效團模型Fig.6 Pharmacophore model for the apigenin and resveratrolF1,F2:hydrogen bond acceptor;F3:hydrogen bond donor&acceptor; F4:hydrogen bond acceptor 2;F5:hydrogen bond donor 2; F6:hydrogen bond donor 2/acceptor 2;F7:hydrophobes/aromatic

圖7 藥效團模型性能測試結果Fig.7 Test results for the pharmacophore modelNHDC:neohesperidin dihydrochalcone;the hit compounds have been marked with asterisk.

GPCR激動劑和抑制劑有不同的結合方式,前者能夠引起跨膜螺旋區(qū)發(fā)生重排,從而改變細胞內C端的構象,暴露出偶聯G蛋白識別位點,最終與G蛋白形成復合物.而抑制劑不能引起相應的構象變化,因此使GPCR的活性受到抑制[8].分子對接研究的結果顯示,TXA2與TP作用于Ser201、Leu98、 Arg295和Thr298,而芹菜苷元和白藜蘆醇等抑制劑與Ser201、Thr298、Arg295均有氫鍵作用,但沒有與Thr298形成氫鍵.這種結合方式的差異可能導致了TP構象的不同變化.因此,TXA2對TP有激活作用,芹菜苷元和白藜蘆醇等抑制劑不能激活TP,而且對TXA2產生了競爭性抑制作用.這可能是抑制作用的分子機理.

2.4 藥效團模型及篩選結果

2.4.1 芹菜苷元和白藜蘆醇的藥效團模型

如圖6所示,建立的藥效團模型由7個藥效元素構成,F1、F2、F3為氫鍵受體或者給體,F4、F5、F6為外部氫鍵受體或者給體,分別對應于芹菜苷元和白藜蘆醇兩端與受體發(fā)生氫鍵結合的位置.其中, F2-F5限制比較嚴格,半徑在0.03-0.05 nm之間. F1和F6比較寬松,半徑為0.15 nm.中間疏水部分由一個疏水/芳香元素F7構成,半徑均為0.6 nm.此外還根據受體活性口袋建立了排斥性空間元素,每個空間元素的半徑為0.13 nm.

2.4.2 藥效團篩選及結果分析

使用藥效團模型對測試數據庫中20個化合物進行篩選,共命中10個化合物(圖7).檢中的化合物多數集中在抑制率20%以上的活性區(qū),抑制率小于5%低活性化合物沒有發(fā)生誤檢的情況,說明該藥效團模型對天然產物中的TP抑制劑有一定的篩選能力,可以滿足初步篩選的需要.但是仍有一些問題存在,例如對黃酮骨架的依賴性比較強,因此對于genistein等異黃酮結構的化合物預測能力較差.使用藥效團模型對ATCMD-3D構象庫進行篩選,共命中261種化合物,其中8種有報道具有抑制血小板聚集活性.其他命中的分子是否有TP抑制作用,還有待進一步研究.

3 結 論

中藥藥效的物質基礎研究是中藥現代化的重要組成部分,中藥作用的靶點分析又是中藥物質基礎的重點研究方向.本文通過同源建模方法,建立了血栓素A2受體蛋白的結構模型,模擬了血栓素與受體的作用方式,并與實驗結果比對驗證了該模型的可靠性.據此,進一步分析芹菜苷元和白藜蘆醇對TP的抑制機理,并構建了抑制劑的藥效團模型,在ATCMD構象數據庫中進行篩選,命中了一批可能具有TP抑制活性的天然產物.研究結果顯示,TP很可能是中藥活血作用的重要靶標.這個結果對基于中藥的先導化合物發(fā)現和新藥開發(fā)有一定的啟發(fā)作用,更深入的研究將在今后逐步展開.

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Molecular Simulations of the Inhibition of Active Components in Traditional Chinese Medicine on the Thromboxane A2 Receptor

LIU Hai-Bo1CUI Wei2XU Jun3,*PENG Yong1,*ZHOU Jia-Ju4XIAO Pei-Gen1
(1Institute of Medicinal Plant Development,Peking Union Medical College,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193,P.R.China;2College of Chemistry and Chemical Engineering,Graduate University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,P.R.China;3School of Pharmaceutical Sciences,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510275,P.R.China;4Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

Some natural products from traditional Chinese medicine(TCM)such as flavones and resveratrol have been reported to have thromboxane A2 receptor(TP)inhibiting activity.We investigated a possible inhibition mechanism by a homology model of TP,which was built based on the crystal structure of squid rhodopsin.After that,docking methods were used to investigate the binding modes of resveratrol and apigenin in the active pocket of TP.Furthermore,a threedimensional pharmacophore model was generated for screening other potential natural TP inhibitors.The results indicate that resveratrol and apigenin bind to the active site of TP similar to the way that thromboxane A2 binds to Ser201,Leu198,Arg295,and Thr298.The former three key residues can form hydrogen bonds with the inhibitors.The pharmacophore model consisted of seven features and a set of volume spheres,which has been proven to be efficient in identifying compounds with high TP inhibition activity.In this way,a set of potential TP inhibitors were screened from a natural product database.Some of them were reported to have platelet aggregation inhibiting activities.This research indicates that TP could be an important target of TCM drugs with blood circulation activation effects.

Traditional Chinese medicine;Drug target;Thromboxane A2 receptor; Blood circulation activating

O641

Received:February 10,2010;Revised:May 5,2010;Published on Web:July 7,2010.

*Corresponding authors.XU Jun,Email:junxu@biochemomes.com.PENG Yong,Email:ypeng@implad.ac.cn;Tel:+86-10-51296683,+86-10-62894462.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(30530860).

國家自然科學基金重點項目(30530860)資助

?Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica