李敬雙,于 洋,唐雨順,張玉科,李 明,李 敏,田莉莉

(遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧錦州121001)

為解決目前肉仔雞免疫效果差、發(fā)病率高以及化藥免疫增強(qiáng)劑存在毒副作用和殘留等問題,我們應(yīng)用中藥蟾酥,依據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)中藥理論,科學(xué)組合,研制開發(fā)了中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑,在實踐應(yīng)用中取得了較好的效果。為進(jìn)一步闡明它增強(qiáng)免疫作用的機(jī)制,本試驗對肉仔雞飼料中添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑后,免疫器官的生長發(fā)育情況以及免疫器官中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的變化情況進(jìn)行了觀察,結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物 1日齡AA健康肉仔雞200羽,購自遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物飼養(yǎng)中心。

1.1.2 藥物 中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑,由本課題組提供。

1.1.3 雞馬立克氏病液氮疫苗(凍克靈Rispens)

凍克靈疫苗系Rispens CVI988株馬立克氏病液氮疫苗,由南京梅里亞動物保健有限公司生產(chǎn)。批號：09R0390。

1.1.4 試劑 4%多聚甲醛固定液,副品紅溶液,六偶氮副品紅溶液,α-醋酸萘酯溶液,反應(yīng)液,甲基綠染色液,甲基綠-派洛寧染液本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 將1日齡AA健康肉仔雞200羽隨機(jī)分為兩組,每組100羽,統(tǒng)一飼喂相同質(zhì)量的全價飼料,1日齡頸部皮下注射凍克靈Rispens,每羽0.2 mL。第一組雛雞分別于第1周(1～7日齡)和第3周(15～21日齡)于飼料中添加0.5%中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑。第二組雛雞作為空白對照。其余管理措施兩組完全一致。

1.2.2 免疫器官生長發(fā)育情況的測定 兩組雛雞分別于14日齡和28日齡,各隨機(jī)抽取發(fā)育正常的20羽個體,空腹稱重,按常規(guī)方法屠宰,分離胸腺、腔上囊和脾臟,用濾紙吸去表面水分后,電子天平稱量濕重。指數(shù)測定,臟器指數(shù) =免疫器官重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.3 免疫器官中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)的檢測 免疫器官中T淋巴細(xì)胞數(shù)的檢測 兩組雛雞分別于14日齡和28日齡無菌采樣,各隨機(jī)采取20羽雛雞胸腺、腔上囊和脾臟的特定部位,固定于4%多聚甲醛,丙酮脫水,石蠟切片,分別進(jìn)行α-醋酸萘酯酶法(ANAE)染色和甲基綠-派洛寧細(xì)胞化學(xué)染色法(PMG)染色,油鏡觀察相應(yīng)區(qū)域單位面積(10 mm2)中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量[1]。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)間差異的顯著性采用SPSS 13.0軟件中的t檢驗,比較處理組與空白對照組的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑對免疫器官生長發(fā)育的影響

2.1.1 對胸腺生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞胸腺的重量和指數(shù)均高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著,(P＜0.05)。在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.1.2 對腔上囊生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞腔上囊的重量和指數(shù)高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著(P＜0.05),在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.1.3 對脾臟生長發(fā)育的影響 在14日齡和28日齡添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞脾臟的重量與指數(shù)均高于空白對照組,其中在14日齡時重量和指數(shù)均差異顯著(P＜0.05),在28日齡時重量差異顯著(P＜0.05),見表1。

2.2 中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑對免疫器官中免疫活性細(xì)胞的的影響14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞胸腺中 T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組在14日齡時胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中的T淋巴細(xì)胞數(shù)、髓質(zhì)中的漿細(xì)胞數(shù)和對照差異顯著(P＜0.05),結(jié)果見表2。

2.2.2 對腔上囊中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)的影響在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞腔上囊淋巴濾泡中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組在14日齡和28日齡腔上囊淋巴濾泡皮質(zhì)和髓質(zhì)中的漿細(xì)胞均和對照組差異顯著(P＜0.05),在28日齡皮質(zhì)中的淋巴細(xì)胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05),結(jié)果見表2。

2.2.3 對脾臟中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)的影響在14日齡和28日齡,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組試驗肉仔雞脾臟中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的數(shù)量均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時脾臟紅髓中的漿細(xì)胞數(shù)和動脈周圍淋巴鞘中的 T淋巴細(xì)胞數(shù)和對照組比較差異顯著(P＜0.05)。在 28日齡時動脈周圍鞘中的漿細(xì)胞數(shù)和T淋巴細(xì)胞數(shù),紅髓中的漿細(xì)胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表1 中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑對免疫器官生長發(fā)育的影響

表2 中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑對免疫器官中T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)的影響

3 討論

3.1 在本試驗中,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組雛雞胸腺、腔上囊和脾臟等免疫器官的重量和指數(shù)均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時兩組間3大免疫器官和重量及胸腺和脾臟的指數(shù)均差異顯著(P＜0.05)。在28日齡時兩組間3大免疫器官的重量及腔上囊的指數(shù)差異顯著(P＜0.05)。免疫器官重量的增加是生長發(fā)育快的表現(xiàn),而指數(shù)的提高意味著免疫系統(tǒng)成熟較快[2],說明在正常飼料中添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑,可促進(jìn)肉仔雞免疫器官的生長發(fā)育和迅速成熟,從而使肉仔雞整體免疫機(jī)能加強(qiáng),抵抗各種病原微生物感染和抗各種應(yīng)激的能力得到提高。

3.2 在本試驗中,添加中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑組肉仔雞胸腺、腔上囊和脾臟中的T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)均明顯高于空白對照組,其中在14日齡時,免疫增強(qiáng)劑組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)中的T淋巴細(xì)胞數(shù)、脾臟動脈周圍鞘的T淋巴細(xì)胞數(shù)和空白對照組差異顯著(P＜0.05);腔上囊皮質(zhì)和髓質(zhì)的漿細(xì)胞數(shù)、胸腺髓質(zhì)和脾臟紅髓的漿細(xì)胞數(shù)和空白對照組差異顯著(P＜0.05)。在28日齡時,免疫增強(qiáng)劑組胸腺髓質(zhì),腔上囊皮質(zhì)及脾臟動脈周圍鞘T淋巴細(xì)胞和對照組差異顯著(P＜0.05);腔上囊皮質(zhì)和髓質(zhì)的漿細(xì)胞數(shù)及脾臟紅髓和動脈周圍鞘中的細(xì)胞數(shù)和對照組差異顯著(P＜0.05)。本試驗所用中藥蟾酥免疫增強(qiáng)劑可明顯促進(jìn)免疫器官中免疫活性細(xì)胞的增殖,提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的機(jī)能[3-4]。

3.3 通過應(yīng)用整體或離體的試驗方法和不同核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其亞群、自身抗體、細(xì)胞因子等多方面的指標(biāo),從不同的側(cè)面揭示了蟾酥及其有效成分對免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。通過溶血空斑形成細(xì)胞(PFC)試驗,E-花環(huán)形成細(xì)胞(ERFC)試驗,聚集IgG抑制ERFC恢復(fù)試驗以及單核、巨噬功能試驗,發(fā)現(xiàn)蟾酥制劑可增高小鼠脾臟抗體形成細(xì)胞活性率,激活小鼠腹腔游走巨噬細(xì)胞,提高其吞噬細(xì)菌和抑制細(xì)菌的能力[5],也能穩(wěn)定提高放射線照射治療后下降的白細(xì)胞數(shù)量[6];日本研究人員,從生藥蟾酥水溶性非透析部分中發(fā)現(xiàn)了促淋巴細(xì)胞增殖物質(zhì),該部分過Con A-瓊脂糖親和色譜柱后,作用明顯增強(qiáng),經(jīng)分析得知,其有效成分之一為含 D-甘露糖、分子量約13 k Da的糖蛋白,純化后能提高脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-2和IL-12的水平,增強(qiáng)C3H/HeN小鼠脾淋巴細(xì)胞的天然殺傷力[7];蟾酥水溶性總成分能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能,提高機(jī)體非特異性免疫作用[8-9];華蟾素制劑能顯著增加環(huán)磷酰胺(CTX)所致的免疫抑制狀態(tài)下的小鼠血清中的IgG含量,顯著增加CTX所致白細(xì)胞減少癥的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù),提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù),表明華蟾素對細(xì)胞免疫,體液免疫和非特異性免疫均有促進(jìn)作用;華蟾素注射液還可以誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-2,增加LAK細(xì)胞的殺傷活性,可見華蟾素制劑的免疫增強(qiáng)作用也是其抗腫瘤作用機(jī)理之一[10]。

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