王 新,崔一喆,韓鐵鎖

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,黑龍江大慶163319)

黃芩苷是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物,具有抗菌、消炎和免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[1]。甲氧芐啶(TMP)為廣譜抗菌增效劑,臨床上常與磺胺類藥物聯(lián)用以增強(qiáng)磺胺類藥物的了抗菌效果,其還可增強(qiáng)多種抗生素以及中藥的抗菌作用[2-3]。而關(guān)于TMP對(duì)黃芩苷的抗菌增效作用未見報(bào)道。為了探討TMP對(duì)黃芩苷抗菌活性的影響,促進(jìn)黃芩苷在防治畜禽傳染性疾病上的應(yīng)用,進(jìn)行黃芩苷與TMP聯(lián)用的性質(zhì)和增效劑量關(guān)系的試驗(yàn),并確定TMP對(duì)黃芩苷體外抗菌增效的最佳劑量,為開發(fā)高效中藥復(fù)方抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 沙門菌(CMCC50115)、大腸桿菌(ATCC35218)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)均購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 藥物 TMP購(gòu)于太原市康瑞寶獸藥制造有限公司,批號(hào)：20080503。黃芩苷購(gòu)于四川什邡市宏升植物原料有限公司,批號(hào)：081102。

1.3 藥物溶液的制備 將128 mg的TMP制成濃度為1 280μg/mL的 TMP溶液100 mL。9.6 g黃芩苷用5%碳酸氫鈉溶液溶解后,再用蒸餾水稀釋成濃度為96 mg/mL的黃芩苷溶液100 mL,用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過除菌后,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌種活化 采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌活化,將菌液稀釋至濁度為 1×107CFU/mL,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 黃芩苷與TMP聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 參照徐淑云報(bào)道[4]的微量棋盤稀釋法進(jìn)行黃芩苷和TMP的聯(lián)合抑菌試驗(yàn),并進(jìn)行組分抑菌濃度(FIC)指數(shù)的計(jì)算和判定藥物聯(lián)合作用的性質(zhì)。

1.6 黃芩苷與TMP聯(lián)用體外抗菌增效試驗(yàn) 用無(wú)菌肉湯將黃芩苷溶液稀釋到2MIC濃度,將TMP溶液稀釋到 640μg/mL、320 μg/mL、160 μg/mL、80μg/mL和40μg/mL濃度。取7只已編號(hào)無(wú)菌試管,1～5號(hào)管分別加入已稀釋的5種TMP溶液1 mL和2MIC的黃芩苷溶液1 mL,6號(hào)管中加入2MIC的黃芩苷溶液和肉湯各1 mL,7號(hào)管為對(duì)照管加入肉湯 2 mL;然后每個(gè)試管中加入 2×106CFU/mL細(xì)菌懸液0.1 mL。充分搖勻后,4℃條件下靜置。分別在1 h、2 h、4 h和8 h,采用平板計(jì)數(shù)的方法測(cè)定菌落數(shù)[5],并計(jì)算殺菌率。其計(jì)算公式為：殺菌率=(對(duì)照管菌落數(shù)-試驗(yàn)管菌落數(shù))/對(duì)照管菌落數(shù)×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS軟件中ANOVA程序進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷與TMP聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 由表1可知,黃芩苷與TMP聯(lián)用對(duì)3種細(xì)菌的MIC值均小于單獨(dú)應(yīng)用,經(jīng)計(jì)算對(duì) 3種細(xì)菌的 FIC指數(shù)均為0.75,呈現(xiàn)相加作用。

2.2 黃芩苷與TMP聯(lián)用體外抗菌增效試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3、表 4。從表中可知,當(dāng) TMP的添加劑量從20μg/mL-160μg/mL時(shí),表現(xiàn)出隨著TMP劑量的增加對(duì)黃芩苷增效作用越強(qiáng),與 TMP 0μg/mL組比較(P＜0.05或P＜0.01);但 TMP添加劑量為160μg/mL與320μg/mL兩組比較差異性不顯著(P＞0.05),表明TMP的添加劑量與對(duì)黃芩苷的增效作用并不是簡(jiǎn)單的直線關(guān)系。利用最小二乘法對(duì)各表的1 h、2 h、4 h和8 h殺菌率數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,擬合度均達(dá)到0.95以上,發(fā)現(xiàn)均符合一元二次方程y=ax2+bx+c;然后依據(jù)公式y(tǒng)max=-b/2a計(jì)算各時(shí)間TMP添加的最優(yōu)值。對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌,TMP添加的最優(yōu)值的平均值分別為 310μg/mL、276μg/mL和 233μg/mL;將TMP添加最優(yōu)值的平均值與黃芩苷的實(shí)際用量進(jìn)行換算,得到TMP對(duì)黃芩苷體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌最優(yōu)添加劑量分別為103.3 mg/g、46.0 mg/g和38.8 mg/g。

表1 黃芩苷與TMP聯(lián)合應(yīng)用的抗菌效果

表2 黃芩苷與不同濃度TMP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)金黃色葡萄球菌的殺菌率 (%)

表3 黃芩苷與不同濃度TMP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌的殺菌率 (%)

表4 黃芩苷與不同濃度TMP聯(lián)合應(yīng)用對(duì)沙門菌的殺菌率 (%)

3 討論

TMP對(duì)中藥增效作用的報(bào)道多是定性的研究[6-8],而TMP最佳添加劑量的研究更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。試驗(yàn)采用了國(guó)內(nèi)外常用的微量棋盤稀釋法測(cè)定了TMP與黃芩苷聯(lián)用的FIC指數(shù),同時(shí)以黃芩苷和TMP的MIC值為基礎(chǔ),設(shè)定了 TMP的系列添加劑量,然后將不同濃度的TMP與MIC濃度的黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌進(jìn)行體外抗菌量效關(guān)系試驗(yàn),采用了4℃靜置的方式使藥物作用于細(xì)菌,避免了37℃恒溫培養(yǎng)時(shí)細(xì)菌呈幾何基數(shù)增殖造成的用藥組與對(duì)照組之間的不可比性;再利用最小二乘法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,從而提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。試驗(yàn)結(jié)果表明,TMP對(duì)黃芩苷發(fā)揮顯著的增效作用。黃芩苷抗菌作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)菌的DNA、RNA、蛋白質(zhì)的生物合成導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡而起到殺菌作用[9],這與TMP抑制細(xì)菌核酸合成的抗菌機(jī)制相近,可能是TMP對(duì)黃芩苷發(fā)揮抗菌增效作用的基礎(chǔ),但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

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