劉 瀾,田 玲,馮華兵,杜繼紅,葛 冰,葛代興,楊秀玉

(1.北京大北農(nóng)動(dòng)物保健技術(shù)研究中心,北京 懷柔 101407;2.北京市農(nóng)業(yè)局,北京 海淀100029;3.北京市獸藥飼料監(jiān)察所,北京 海淀100107;4.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 海淀100081)

氟苯尼考(FFC)是動(dòng)物專用廣譜抗菌藥,臨床用于預(yù)防和治療畜禽的各種細(xì)菌感染,但常規(guī)制劑往往治療效率較低[1]。肺靶向氟苯尼考明膠微球是指將氟苯尼考分散在明膠中形成的微球狀分散體系,它可通過控制明膠微球的球徑范圍,將藥物最大限度地運(yùn)送到肺部組織,使藥物在肺部濃集超出傳統(tǒng)制劑的數(shù)倍乃至數(shù)百倍,以達(dá)到靶向治療作用。近年來,國內(nèi)外學(xué)者[2-8]研究表明,明膠微球粒徑在5～30μm之間,微球靜脈注射后經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肺部,可被分布在肺組織的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬或被肺部毛細(xì)血管機(jī)械性攝取,而呈現(xiàn)良好的肺靶向性。本試驗(yàn)以明膠為載體,采用兩步法制備了氟苯尼考肺靶向明膠微球(florfenicol gelatin microspheres,FFC-GMS),并通過單因素試驗(yàn)、均勻試驗(yàn)、正交試驗(yàn)對(duì)影響微球粒徑、形態(tài)等的因素進(jìn)行了考察,優(yōu)化處方、工藝,為肺靶向氟苯尼考明膠微球的制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 掃描電子顯微鏡(S-3400N,日本HITACHI);DSC掃描儀(diamond 6,PE);激光粒度分布儀(2000,馬爾文);高效液相色譜儀(Waters2487,美國 Waters);恒速數(shù)顯攪拌機(jī)(JHS-2/60,杭州儀表電機(jī)有限公司);數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(07HWS-1,杭州儀表電機(jī)有限公司);超聲波清洗器(KQ5200,昆山市超聲儀器有限公司);生物顯微鏡(XSP-C203,重慶光學(xué)儀器有限公司);真空干燥箱(DZ-1BC,天津泰斯特)。

1.2 試驗(yàn)藥品與試劑 氟苯尼考購自浙江海翔藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：P048-2008243);氟苯尼考對(duì)照品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(批號(hào)：K0300801,含量：99.5%);明膠、液體石蠟、Span-80、Tween-80、石油醚、甲醛、異丙醇均購自北京化學(xué)試劑公司(化學(xué)純);胃蛋白酶購自北京化學(xué)試劑公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 空白明膠微球(gelatin microspheres,GMS)的制備 采用乳化交聯(lián)法制備空白明膠微球[3],以明膠水溶液為分散相,液體石蠟為連續(xù)相,加入適宜的乳化劑,機(jī)械攪拌得穩(wěn)定乳劑(w/o),然后加入異丙醇脫水再加入甲醛或戊二醛交聯(lián)固化制成明膠微球。

2.1.1 油相、乳化劑的選擇 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6,9],選擇以液體石蠟為油相,考察以Tween-80、Span-80或兩者的混合物作為乳化劑時(shí)制得的乳劑的穩(wěn)定性,從而進(jìn)行乳化劑的篩選,結(jié)果見表1。結(jié)果表明以Tween-80和Span-80(w/w為1∶1)為混合乳化劑效果最好。

表1 乳化劑對(duì)乳化效果的影響

2.1.2 固化條件的選擇 先將10%明膠溶液分散于液體石蠟中,機(jī)械攪拌,嘗試用甲醛或戊二醛、異丙醇固化制得明膠微球,通過顯微鏡觀察微球的外觀形態(tài)。通過預(yù)試驗(yàn),甲醛和戊二醛的固化效果無顯著性差別,正式試驗(yàn)我們選擇以甲醛和異丙醇作為固化劑,固化時(shí)間分別為1 h,考察不同的甲醛、異丙醇投料量對(duì)微球形態(tài)的影響。結(jié)果見表2。隨著甲醛和異丙醇投料量的增多,得到的球形顆粒增多,粘連減少,流動(dòng)性增強(qiáng),但是增加到一定程度后,這種改變趨勢(shì)減弱,綜合考慮工藝、成本、有機(jī)溶劑的殘留等因素,選擇以10 mL甲醛和20 mL異丙醇為固化劑。

2.1.3 GMS制備工藝的優(yōu)化 綜合考察影響微球形成的5因素(明膠濃度、油相體積、乳化劑用量、乳化溫度、攪拌速率),對(duì)其進(jìn)行5因素4水平的均勻試驗(yàn)。均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見表3。通過光學(xué)顯微鏡直接觀察GMS的均勻性、粒徑范圍、形狀與粘連程度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)編號(hào)2、編號(hào)3較好,但仍有粘連且形態(tài)不完美。

表2 甲醛和異丙醇對(duì)微球形態(tài)的影響

表3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)均勻試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[4,10]確定乳化溫度為60℃。進(jìn)一步采用4因素3水平的正交試驗(yàn),將GMS的平均粒徑(S1)、粒徑分布均勻程度(S2)、不粘連程度(S3)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),分別評(píng)分。每批評(píng)價(jià)500個(gè)微球,且對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分S(S=S1+S1-S3),S愈高,微球的質(zhì)量越好,詳見表4。從表4中可以看出編號(hào)6總分最高。綜合分析確定GMS最佳制備工藝為：明膠濃度10%,油相體積為55mL,乳化劑用量為0.4g,乳化溫度為60℃,攪拌速率為1000r/min。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.4 GMS的制備工藝 將已充分溶脹的10%明膠溶液8mL滴入含有0.4g乳化劑的55mL液體石蠟中,在 60℃水浴中攪拌乳化15min,轉(zhuǎn)速1000r/min。冰水浴迅速冷卻,以細(xì)流狀加入20mL異丙醇攪拌1h,再加入甲醛10mL,攪拌交聯(lián)固化1h,抽濾。用異丙醇-乙醚洗滌,至洗盡甲醛,用石油醚洗去微球表面的液體石蠟,真空干燥。過200目篩,得類白色微球粉末。用光散色法測(cè)定微球平均粒徑為10.23μm,粒徑范圍5.0～30μm的數(shù)目占總數(shù)的90.8%,結(jié)果見圖1。

2.2 FFC-GMS制備工藝的確定 采用兩步法制備氟苯尼考明膠微球,將氟苯尼考溶解于30%二甲基甲酰胺水溶液中,加入GMS,靜置浸入2h,抽濾,用蒸餾水洗凈二甲基甲酰胺,真空干燥,過200目篩,得類白色微球粉末,形態(tài)見圖2。用光散色法測(cè)定微球平均粒徑為10.57μm,粒徑范圍5.0～30μm的數(shù)目占總數(shù)的88.3%,達(dá)到肺部靶向的設(shè)計(jì)要求。

圖1 明膠微球的粒徑分布

2.3 差示掃描量熱法驗(yàn)證FFC-GMS的形成 操作條件：掃描溫度30℃～350℃,掃描速度20deg?min-1,分別測(cè)得FFC、GMS與FFC-GMS的DSC曲線。結(jié)果見圖3。從曲線上看出FFC在270℃左右有特征峰,GMS在 300℃左右有特征吸收峰,但FFC-GMS基本上無FFC或GMS的特征吸收峰,而有其本身245℃左右有特征峰,說明確實(shí)形成了FFC-GMS。

圖2 氟苯尼考明膠微球

圖3 差示掃描量熱法曲線

2.4 FFC-GMS中載藥量的測(cè)定 稱取一定量微球,置于燒杯中,加入20 mL蒸餾水,加入0.2 g胃蛋白酶,用稀鹽酸調(diào)溶液p H值至3.5,而后將燒杯置于40℃±3℃水溶液中攪拌水解3 h,破壞明膠微球使氟苯尼考釋放[11];再加入20 mL N,N-二甲基甲酰胺,繼續(xù)攪拌30 min后用0.22 m的微孔濾膜過濾,濾液用N,N-二甲基甲酰胺定容至50 mL。

2.4.1 回收率 精密稱取20 mg干燥空白明膠微球,分別加入氟苯尼考 1 mg、2.5 mg、5 mg,同上操作后,精密量取10μL濾注入液相色譜儀,記錄色譜圖。另取氟苯尼考對(duì)照品適量,加入流動(dòng)相制成濃度為50μg/mL的溶液,同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算氟苯尼考濃度。色譜柱：MSC-18;流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸(500∶985∶15);檢測(cè)波長為224 nm。測(cè)得低、中、高不同加入量的平均回收率為102.1%(n=5)。

2.4.2 氟苯尼考藥物含量的測(cè)定 精密稱取干燥微球20 mg,同上操作后,精密量取10μL濾注入液相色譜儀,記錄色譜圖。另取氟苯尼考對(duì)照品適量,加入流動(dòng)相制成濃度為50μg/mL的溶液,同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算氟苯尼考濃度。色譜柱：MSC-18;流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸(500∶985∶15);檢測(cè)波長為224 nm。得FFC-GMS中載藥量為121.2 mg/g(n=3)。

2.5 FFC-GMS藥物包封率的測(cè)定 精密稱取干燥樣品20 mg,用少量蒸餾水渦旋洗滌3次后棄去洗液,殘余微球70℃烘干。按2.4項(xiàng)下方法測(cè)定水洗后微球中的氟苯尼考含量,并計(jì)算包封率,得FFC-GMS藥物包封率為90.31%。

2.6 FFC-GMS穩(wěn)定性考察 將FFC-GMS密封于西林瓶內(nèi),分別置于 4℃,室溫(20℃±5℃)和40℃相對(duì)濕度75%的條件下3個(gè)月,每月檢查,其外觀、形態(tài)、載藥量幾乎無變化,結(jié)果見表5。說明FFC-GMS穩(wěn)定性較好。

3 討論

3.1 GMS的制備工藝 本試驗(yàn)以明膠為載體,采用乳化交聯(lián)法制備了肺靶向明膠微球。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及單因素考察確定了油相、乳化劑和固化條件,運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法考察了影響成球的五個(gè)因素包括明膠濃度、油相的體積、乳化劑的用量、乳化溫度和攪拌速率,并通過方差分析發(fā)現(xiàn)明膠濃度對(duì)成球效果的影響最顯著,其次為乳化劑用量、攪拌速率、連續(xù)相體積、乳化溫度,進(jìn)一步優(yōu)化并確定了制備工藝。用該工藝制備的微球外觀形態(tài)較好,平均粒徑為10.23μm,粒徑范圍5.0μm～30 μm的數(shù)目占總數(shù)的90.8%。

3.2 FFC-GMS的制備工藝 氟苯尼考在水中的溶解性較差,如直接采用乳化交聯(lián)法制備微球,微球的含藥量較低。本試驗(yàn)采用兩步法,以30%二甲基甲酰水溶液為溶劑不僅能夠較好的溶解氟苯尼考,而且能夠很容易的浸潤明膠微球,且溶液可反復(fù)用于浸泡,提高藥物收率并最終得到載藥量較高的氟苯尼考肺靶向明膠微球。

3.3 FFC-GMS的體外評(píng)價(jià) 影響微球肺靶向的主要因素是微球粒徑的大小,國內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)5～30μm的微球靜脈注射后在肺部蓄積。本試驗(yàn)方法制得的FFC-GMS的平均粒徑為10.57μm,粒徑范圍5.0～30μm的數(shù)目占總數(shù)的88.3%,達(dá)到肺部靶向的設(shè)計(jì)要求。對(duì)氟苯尼考肺靶向明膠微球載藥量和包封率進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,本試驗(yàn)方法制備的氟苯尼考肺靶向明膠微球載藥量較高,平均載藥量為121.2 mg/g;采用水洗法測(cè)定藥物的包封率達(dá)為90.31%,表明微球的制備工藝較好。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果