張小兵,吳 萌,邸祿芹,李君華,齊穎穎,閆靜輝

(1.河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050081;2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

目前,青霉素作為β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物,是牛奶中最常見(jiàn)的殘留抗生素。由于乳品企業(yè)對(duì)抗生素殘留超標(biāo)的牛乳拒收,于是,一些不法奶站為了謀求自己的經(jīng)濟(jì)利益,便使用一些生物制劑去降解牛乳中殘留的抗生素,生產(chǎn)所謂“無(wú)抗奶”。2009年2月,衛(wèi)生部公布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第二批)》中指出金玉蘭酶制劑(β-內(nèi)酰胺酶)為掩蔽乳及乳制品中抗生素的非法添加物。β-內(nèi)酰胺酶能夠使青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)破壞而失去活性,導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)青霉素、頭孢菌素等抗生素類(lèi)藥物的耐藥性增高。

為了準(zhǔn)確、特異和快速地檢測(cè)這種添加物,我們以金玉蘭酶制劑為抗原,制備了相應(yīng)的單克隆抗體,為利用免疫學(xué)方法檢查牛奶中的金玉蘭酶制劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器 BALB/c小鼠(河北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),β-內(nèi)酰胺酶(金玉蘭酶制劑),HAT、H T、PEG、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑(Sigma公司),小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞(本研究室保存),DMEM培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)板(GIBCO),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),小鼠單克隆抗體亞型試劑盒(Sigma公司),辣根過(guò)氧化物酶(HRP,北京華美生科生物技術(shù)有限公司)。兔抗金玉蘭酶制劑多抗(自制)。其他試劑均為分析純。

96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(廈門(mén)市云鵬科技發(fā)展有限公司)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Tecan公司)、凝膠成像儀(UVP)。

1.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立[1]用6只7～8周齡BALB/c小鼠,基礎(chǔ)免疫用福氏完全佐劑與等體積β-內(nèi)酰胺酶溶液(β-內(nèi)酰胺酶100 μg/只小鼠)混合乳化后頸背部多點(diǎn)注射。兩周后第2次免疫,用福氏不完全佐劑與首次相同劑量抗原乳化后頸背部多點(diǎn)注射。再兩周后,測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。選取最佳免疫小鼠于融合前3 d腹腔注射抗原液100μg,作加強(qiáng)免疫。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞,按常規(guī)方法進(jìn)行融合。檢測(cè)培養(yǎng)上清抗體效價(jià),選擇強(qiáng)陽(yáng)性克隆,用有限稀釋法連續(xù)亞克隆,直至100%陽(yáng)性。將建立的穩(wěn)定分泌高特異、高效價(jià)抗體的雜交瘤細(xì)胞株,置液氮中保存。

1.3 單克隆抗體的制備及特性分析 將各細(xì)胞株分別接種于預(yù)先致敏的成年BALB/c小鼠腹腔內(nèi),7～10 d后收集腹水。以間接 EL1SA法測(cè)定抗體效價(jià)。

單抗靈敏度測(cè)定也采用間接ELISA法;β-內(nèi)酰胺酶起始濃度為5μg/mL,倍比稀釋后包被酶標(biāo)板;腹水抗體的工作濃度為1∶5 000～1∶10 000。以β-內(nèi)酰胺酶陰性鮮牛奶包被酶標(biāo)板,測(cè)定各抗體特異性。采用Sigma公司抗體亞型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體類(lèi)型及亞類(lèi)。用蛋白A純化小鼠腹水[2-3],SDS-PAGE法檢測(cè)抗體純度[4],并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。采用紫外吸收法[5]對(duì)抗體濃度進(jìn)行測(cè)定。單抗的親和力常數(shù)用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫法[6]測(cè)定。抗體標(biāo)酶采用高碘酸鈉法[7]。

ELISA相加試驗(yàn)[8]測(cè)定單克隆抗體抗原表位。以β-內(nèi)酰胺酶包被酶標(biāo)板,分別在不同的孔中加入McAb(1和2)和同時(shí)加入兩株McAbs(1+2),然后加入酶標(biāo)記的羊抗鼠Ig,以四甲基聯(lián)苯胺為底物,終止反應(yīng)后測(cè)得OD值A(chǔ) 1、A 2和A 1+2。

McAbs最佳配對(duì)的選擇,按方陣交叉匹配法[9]進(jìn)行。分別以各種McAbs包被酶標(biāo)板,以β-內(nèi)酰胺酶為中心抗原,和每種HRP標(biāo)記的McAb逐一進(jìn)行交叉匹配試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠抗β-內(nèi)酰胺酶雜交瘤細(xì)胞株的建立 共進(jìn)行了兩次細(xì)胞融合,每次用6塊96孔板,平均每孔有1～2株融合細(xì)胞生長(zhǎng),融合率為100%。經(jīng)過(guò)對(duì)陽(yáng)性孔多次亞克隆,共獲得16株穩(wěn)定分泌抗β-內(nèi)酰胺酶的雜交瘤細(xì)胞株。分別命名為：1B3、1B10、1C2、1H 3、2H5、3B6、3H8、3H 6、3G4、4H2、4H 8、4G11、4F11、4D11、5C10、5C8 。

2.2 抗體的制備及純化 16株雜交瘤細(xì)胞株分別注射到成年BALB/c小鼠腹腔內(nèi)誘發(fā)腹水,每只獲取3～9 mL腹水。腹水效價(jià)為1∶10萬(wàn)～1∶1 310萬(wàn)。靈敏度測(cè)定結(jié)果表明,大多數(shù)抗體可檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的最低濃度在39 ng/mL～150 ng/mL之間,而單抗4F11的最低檢測(cè)濃度是19 ng/mL。分別取2～3 mL進(jìn)行純化,純化后蛋白含量15.6 mg/mL～33.3 mg/mL,凝膠成像分析純度達(dá) 87%～93%。

林業(yè)生態(tài)保護(hù)與天然林保護(hù)不僅會(huì)影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，也會(huì)給人類(lèi)的生活帶來(lái)影響。所以，我們應(yīng)該加強(qiáng)保護(hù)工作，使林業(yè)能夠可持續(xù)發(fā)展。我國(guó)的經(jīng)濟(jì)建設(shè)也離不開(kāi)林業(yè)的支持，只有不斷提高森林覆蓋率，才能有效推動(dòng)我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

2.3 抗體特性鑒定

2.3.1 抗體的特異性和亞型鑒定 在用陰性鮮牛奶包被酶標(biāo)板的間接ELISA試驗(yàn)中,各單克隆抗體與之皆無(wú)交叉反應(yīng);用Sigma公司的抗體亞型試劑盒鑒定,結(jié)果 3H 6為 IgG2a,3G4和 4G11為IgG2b,其余皆為IgG1(見(jiàn)中插彩版圖1)。

2.3.2 單克隆抗體識(shí)別抗原表位特性分析 為了測(cè)定單抗識(shí)別抗原表位的特性,先以棋盤(pán)法測(cè)定酶標(biāo)記羊抗鼠Ig的飽和度,并測(cè)定抗原與McAbs的飽和濃度。在本試驗(yàn)系統(tǒng)中,酶標(biāo)記羊抗鼠Ig為1∶3 000倍稀釋,各株單抗腹水根據(jù)所測(cè)飽和濃度分別作1∶400～1∶1 000倍稀釋。

所測(cè)OD.值利用如下公式計(jì)算相加指數(shù)(addictivity index,AI),結(jié)果以AI值的大小判定。公式：

若兩株McAbs識(shí)別抗原的同一表位,A 1+2應(yīng)等于A1和 A2的均值,AI應(yīng)為零;若兩株McAb識(shí)別不同的表位,A 1+2應(yīng)等于A 1和A 2的總和,AI則等于100%。實(shí)際測(cè)定中,一般以AI值小于50%判定為識(shí)別相同的表位,以AI值大于50%判定為識(shí)別不同的表位。

結(jié)果表明,只有單克隆抗體5C10與3B6互交相加后,計(jì)算得出的 AI值大于 50%(AI值為76.1%),具有相加性,它們識(shí)別抗原上不同的表位且表位的距離較遠(yuǎn);其余各單抗間,AI值均小于50%,則這些單抗所結(jié)合的表位是相同或距離較近,彼此間有空間位阻,沒(méi)有互補(bǔ)或相加的特性。

2.3.3 最佳配對(duì)的選擇 所獲得單抗中有三株的效價(jià)達(dá)1∶1 310多萬(wàn),它們是1B10、2H5和4F11。據(jù)相加試驗(yàn)的結(jié)果,初步判定這3株抗體結(jié)合的表位是相同或相似的。于是,先對(duì)4F11進(jìn)行標(biāo)酶。標(biāo)酶后 ,用β-內(nèi)酰胺酶、β-內(nèi)酰胺酶陰性牛奶、小牛血清和單克隆抗體4F11分別包被酶標(biāo)板,選擇標(biāo)酶后4F11(4F11-HRP)的初始濃度為2.5μg/mL,按2n(n=0,1,2…)倍比稀釋,進(jìn)行4F11-HRP的特異性測(cè)定(見(jiàn)中插彩版圖2)。

進(jìn)行單抗最佳配對(duì)選擇試驗(yàn)時(shí),用4F11和兔抗β-內(nèi)酰胺酶多抗分別包被酶標(biāo)板,并用與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)陰性的血清包被酶標(biāo)板做陰性對(duì)照,選擇β-內(nèi)酰胺酶的初始酶活為 1 500酶活單位/μL,按2n(n=0,1,2…)倍比稀釋。發(fā)現(xiàn)4F11-HRP可分別與單抗4F11和兔多抗配對(duì)檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺酶,結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖3。

抗原分子上的表位,是有線性的氨基酸殘基或者非連續(xù)序列折疊形成的緊密的三維結(jié)構(gòu),它們?cè)诳乖谋砻?是局部表面結(jié)構(gòu)[10]。4F11-HRP能與4F11配對(duì)檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺酶,表明該抗原分子表面有兩個(gè)或兩個(gè)以上相同或相似的表位;且其中,至少有2個(gè)這樣的表位之間的距離較遠(yuǎn),能同時(shí)結(jié)合2個(gè)4F11分子。于是,利用一支單抗就可以采用雙抗夾心ELISA法完成對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。這樣就可以極大的縮短單抗的制備周期,降低成本,加快金玉蘭酶制劑免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立。另外,由圖3中還可以看出,4F11結(jié)合β-內(nèi)酰胺酶的能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于兔多克隆抗體,即β-內(nèi)酰胺酶濃度較高時(shí),所測(cè)得OD值表現(xiàn)出明顯差異。這是因?yàn)閱慰故怯蓡蝹€(gè)雜交瘤克隆分泌的抗體組成,具有均質(zhì)性,各抗體分子的親和力完全一致;在抗原檢測(cè)上具有高度一致的特性。多抗則不同,是含有不同親和力抗體的復(fù)雜混合物。

試驗(yàn)結(jié)果表明,1B10、2H5和4F11均可實(shí)現(xiàn)單株抗體對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢查;并各株單抗之間均能配對(duì)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶。因此,可初步推斷這3株單抗是抗同一表位的抗體。

2.3.4 親和力測(cè)定 僅對(duì)以上3種效價(jià)最高的單抗進(jìn)行了親和力測(cè)定。結(jié)果顯示,3株抗體的親和力為1×107L/mol～1×1010L/mol,其中,4F11的親和力是1×1010L/mol(見(jiàn)中插彩版圖4)。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)制備和選定的4F11、2H 5和1B10等幾株單克隆抗體,效價(jià)高,抗β-內(nèi)酰胺酶特異性好;并且利用一支單克隆抗體,通過(guò)雙抗夾心ELISA法就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的免疫學(xué)檢測(cè)。這些抗體很適合用于研制有關(guān)檢測(cè)牛奶中添加的β-內(nèi)酰胺酶的試劑盒。

[1] 金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社,2002：9-17.

[2] Mckinney M M,Parkinso A.A Simple,Non-chromatographic Procedure to Purity Immunoglobulins From Serum and Ascites[J].Immunol Methods,1987,96：271.

[3] 劉玉翠,鄒岳奇,閆靜輝,等.辛酸沉淀純化單克隆抗體的研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào),1991(2)：56-61.

[4] 奧斯伯 F.新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].王海林,譯.北京：科學(xué)出版社,1998：333-338.

[5] 溫進(jìn)坤,韓梅.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)普及出版社,1999：192-194.

[6] 董志偉,王琰.抗體工程[M].2版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社,2002：218-225,280-282.

[7] 劉玉翠,鄒岳奇,閆靜輝.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體的初步研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào),1991(1)：39-42.

[8] 劉蘇燕,董邦全,李恩善.分析不同單克隆抗體識(shí)別的表位特異性的三種ELISA方法比較[J].上海免疫學(xué)雜志,1991,11(2)：108-109,112.

[9] Chii Yuh Kuo,Kuang Wei Chen,Joseph Fu,et al.Generation of Monoclonal Antibodies to Prostatic Acid Phosphatasc Isoenzyme 2 and Application in Solid-Phase Enzyme Immunoassay[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,1989,11：8995.

[10]哈洛E.蘇思D.抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M].沈關(guān)心,龔非力,譯.北京：科學(xué)出版社,2002：19.