趙光偉,王 帆,趙春燕,楊曉偉

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系,重慶 榮昌402460;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京210095)

干擾素(IFN)是機體天然免疫防御系統(tǒng)中的一類細胞因子,是一類具有廣譜抗病毒、增強動物對各種疾病的免疫力等多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的豬干擾素包括 IFN-α、β、γ、δ、ω等[1],其中研究較熱的有IFN-α,IFN-γ,對 IFN-ω的研究鮮有報道。IFN-ω是由5個以上的相關(guān)功能基因編碼的[2],蛋白質(zhì)家族中與IFN-α亞型之間同源性很高,天然的IFN-α常常是IFN-α與IFN-ω功能基因表達產(chǎn)物的混合體。目前臨床中廣泛使用的干擾素大多是利用基因工程技術(shù)表達出的單純IFN-α的蛋白,這與天然的IFN-α存在一定的差異,這可能是導(dǎo)致實際臨床使用時其效果相對較差的原因之一。榮昌豬是我國一個優(yōu)良的地方品種,在川渝地區(qū)飼養(yǎng)存欄量很高。本試驗旨在對榮昌豬IFN-ω進行克隆,獲得目的基因,為進一步了解IFN-ω在榮昌豬抗感染、抗病毒免疫應(yīng)答中的作用,提高榮昌豬的抗病能力以及豐富榮昌豬的基因資源做鋪墊,發(fā)展榮昌豬養(yǎng)殖業(yè)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1月齡榮昌仔豬,購自重慶種豬場。

1.2 試劑 pMD18-T載體、T4連接酶、膠回收試劑盒、淋巴細胞分離液購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Catrimox-14TM RNA提取試劑盒、禽源反轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)、Taq酶、dNTP、RNA 酶抑制劑等購自TaKaRa公司,宿主菌JM109由本實驗室保存;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 榮昌豬外周血淋巴細胞(PBMC)的分離與培養(yǎng) 無菌采取健康榮昌豬血10 mL,分離淋巴細胞。將白細胞層移于另一試管,加等量RPMI 1 640液,2 000 r/min離心20 min,棄上清,沉淀物再加入等量RPMI 1 640液,同上離心3次,去上清;沉淀細胞用含10μg/mL ConA、100 mL/L小牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)液(含100μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)懸浮,取10μL細胞懸液計數(shù),將細胞懸液稀釋至5×106/mL,置于細胞培養(yǎng)板中,5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12 h。

1.4 榮昌豬總RNA的抽提 收集培養(yǎng)后的細胞,利用Catrimox-14 RNA提取試劑盒提取總RNA,操作方法嚴(yán)格按試劑盒使用說明書進行。提取的RNA保存于-80℃,備用。

1.5 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的野豬IFN-ω基因序列(EU797619),利用生物軟件設(shè)計如下一對引物：上游引物：ATGGCCTTTGTGTTCTCTC;下游引物：TCAGGATGACCCCAGGTCTA,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.6 榮昌豬 IFN-ω基因的體外擴增 反轉(zhuǎn)錄條件：采用 20μL反應(yīng)體系,其中模板 RNA 5μL,dNTP Mixture 1μL,5×RT-PCR Buffer 4 μL,MMulv Reverse Transcriptuse 1μL,Rnase inhibitor 0.5μL,特異下游引物 1μL,Rnase Free H 2O 7.5μL。反應(yīng)條件30℃min,42℃40 min,95℃5 min。PCR條件：采用50μL反應(yīng)體系,其中模板5 μL,上、下游特異引物各1 μL,LA Taq DNA Polymerase 0.5μL,d NTP Mixture 1 μL,dd H2O 16.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min,94℃30 s,54.6℃30 s,72℃50 s,35個循環(huán),72℃延伸10 min。后1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,并利用膠回收試劑盒回收特異的573 bp的DNA條帶。

1.7 擴增片段的克隆與重組子的鑒定 將PCR產(chǎn)物連接到p MD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109感受態(tài)細胞,通過藍白斑篩選,選取藍斑用小量提取法提取其質(zhì)粒,進行PCR鑒定。

1.8 序列測定與分析 將初步鑒定的重組子質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司測序。序列測定結(jié)果利用DNAStar軟件進行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 榮昌豬IFN-ω基因的體外擴增結(jié)果 榮昌豬IFN-ω基因的RT-PCR結(jié)果如圖1所示,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,獲得大小為573 bp的目的條帶。

2.2 榮昌豬IFN-ω基因的測序結(jié)果(見圖2) 榮昌豬IFN-ω基因測序結(jié)果如圖 3所示,序列全長573 bp,含一個完整的開放閱讀框(ORF),共編碼191個氨基酸。

2.3 榮昌豬IFN-ω基因與其他動物IFN-ω基因同源性比較和進化樹分析(見圖3) 由圖3可知,榮昌豬IFN-ω基因與野豬的的同源性最高,為99.5%,而與其他動物IFN-ω基因的同源性較低,其中與牛、野馬、貓和人的同源性分別為66.0%,63.7%,47.6%,24.5%,由此可見,榮昌豬IFN-ω基因與野豬的進化關(guān)系最接近。

2.4 榮昌豬IFN-ω基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測與抗原性分析見圖4。

由圖4可見,榮昌豬 IFN-ω基因具有 9個α螺旋,2個β折疊,10個轉(zhuǎn)角和8個無規(guī)則卷曲,說明其二級結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。對其抗原性分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)其抗原性強的氨基酸位點較多,主要集中在35～75,95～130,150～190三個區(qū)域中,而其非抗原性的氨基酸位點少并且強度也比較弱,由此說明,榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白具有良好的抗原性,極有可能增強榮昌豬的免疫力。對其進行疏水性分析發(fā)現(xiàn),榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白疏水性不強,具有12個親水位點,其中有3個是強親水位點。

圖1 榮昌豬IFN-ω基因的RT-PCR

3 討論

榮昌豬原產(chǎn)于重慶榮昌和隆昌兩縣,由于其適應(yīng)性強、雜交配合力好、遺傳性能穩(wěn)定、瘦肉率較高、肉質(zhì)優(yōu)良、鬃白質(zhì)好等優(yōu)點,目前已經(jīng)發(fā)展到全國除臺灣外的各個省市,產(chǎn)區(qū)每年向外提供仔豬達140萬頭以上[3],是我國養(yǎng)豬業(yè)推廣面積最大、最具有影響力的地方豬種之一。因此,對榮昌豬生物制品進行前期的研發(fā)是發(fā)展榮昌豬產(chǎn)業(yè)的必要保障。

本試驗通過RT-PCR技術(shù),從榮昌豬血液淋巴細胞中成功擴增出一特異條帶,經(jīng)序列測定,與GenBank上登載的野豬IFN-ω基因(EU797619)的同源性為99.5%,這證明已經(jīng)成功克隆到榮昌豬IFN-ω基因。通過與其他物種的IFN-ω基因?qū)Ρ?表明與野豬的同源關(guān)系最為密切,與牛、野馬、貓和人的關(guān)系分別次之。進而對其翻譯蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)IFN-ω蛋白具有較強的抗原性,主要集中在35～75,95～130,150～190三個區(qū)域中,這對于研究開發(fā)IFN-ω的生物制劑具有重要的指導(dǎo)意義。較強的抗原性通常具有較強的親水性,雖然其原因還不甚明了,但該基因也符合這一規(guī)律,榮昌豬IFN-ω基因翻譯的蛋白疏水性不強,具有12個親水位點,其中有3個是強親水位點。

干擾素是參與免疫調(diào)節(jié)的重要細胞因子,能夠全面的促進體液免疫和細胞免疫,在抗病毒,抗腫瘤和增強免疫力方面發(fā)揮著重要的作用[4]。目前,臨床生產(chǎn)中使用的干擾素多為利用基因工程表達的純IFN-α的蛋白,由于IFN-ω是天然 IFN-α的功能基因表達產(chǎn)物之一,因此臨床使用的干擾素與天然干擾素之間存在差異,這或許是臨床使用干擾素時效果較天然干擾素較差的原因之一,本試驗利用分子生物學(xué)技術(shù)將榮昌豬IFN-ω基因進行克隆,為開發(fā)研制其生物制劑奠定基礎(chǔ),以期能夠提高干擾素的抗病效果。

[1] Lebon A,Toughd F.Links between innate and adap tive immunity via type I interferon[J].Current Opinion in Immunology,2002,14(4)：432-436.

[2] 李臣賓.IFN-ω的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)：免疫學(xué)分冊,2005,28(1)：7-9.

[3] 趙敏,張庭科,郝靜,等.榮昌豬的品種特性與發(fā)展現(xiàn)狀[J].中國牧業(yè)通訊,2009,22：32-34.

[4] Haller O,Kochs G,Weber F.Interferon,Mx,and viral countermeasures[J].Cy tokine and Growth Factor Reviews,2007,18(5)：425-433.