吳荔琴,方炳虎,肖田安,鄧國東

(1.廣東省獸藥與飼料監(jiān)察總所,廣東 廣州510230;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州510642)

馬杜霉素,又名馬度米星,馬杜拉放線菌發(fā)酵產(chǎn)物分離獲得,是聚醚類抗生素(PEs)中藥效最強(qiáng)的一種。該藥由美國氰胺公司于20世紀(jì)80年代開發(fā)成功,1992年在我國研制成功并大批量生產(chǎn)。馬杜霉素對(duì)柔嫩艾美耳、堆型艾美耳、布氏艾美耳、變位艾美耳及毒害艾美耳球蟲都有很好的驅(qū)殺效果[1],不易產(chǎn)生耐藥性,可與其他抗生素、磺胺類及呋喃類藥物配伍使用[2],且價(jià)格合適,因此在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計(jì),1996年馬杜霉素已取代莫能菌素、鹽霉素、拉沙里菌素占國內(nèi)抗球蟲藥物使用量的首位。2004年對(duì)全國各地共545個(gè)雞場(chǎng)進(jìn)行調(diào)查,其中有525個(gè)雞場(chǎng)在飼料中添加了馬杜霉素預(yù)防球蟲病[3]。

1 馬杜霉素性質(zhì)概述

1.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 馬杜霉素呈酸性,p Ka 6～8,屬于極性較低的化合物。市場(chǎng)上銷售馬杜霉素銨鹽,其為白色或類白色晶體性粉末,溶于甲醇、乙腈或三氯甲烷,不溶于水[4]。馬杜霉素為多環(huán)醚結(jié)構(gòu)有機(jī)酸,基本骨架由一定數(shù)量含氧雜環(huán)(四氫呋喃和四氫吡喃)連接而成的開鏈結(jié)構(gòu),一端連接羧基,另一端含羥基,骨架上連接有眾多甲基、甲氧基和羥基[5]。馬杜拉放線菌發(fā)酵產(chǎn)生α、β兩種組份。其中,α組份活性強(qiáng),占 91%～97%;β組份較α組分在A環(huán)上少一個(gè)甲基,活性遠(yuǎn)不如α組份[6]。α組份的分子結(jié)構(gòu)式如圖1。

1.2 藥理作用 馬杜霉素易與金屬離子(Na+、K+、Ca2+)形成離子復(fù)合物。這種復(fù)合物脂溶性強(qiáng),易進(jìn)入生物膜脂質(zhì)層,使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化,進(jìn)而影響滲透壓,使球蟲細(xì)胞崩解,達(dá)到殺滅球蟲的效果[7]。該藥主要作用于球蟲無性繁殖的早期階段,通過干擾球蟲子包子或裂殖子細(xì)胞的離子平衡,影響一些酶的活性,或?qū)е卤砟せ蚣?xì)胞器破裂,阻止其侵入宿主腸上皮細(xì)胞。馬杜霉素的作用特點(diǎn)決定了其特別適宜作為預(yù)防用藥,且該作用機(jī)制缺乏特異性,不易產(chǎn)生抗藥性[5]。

1.3 代謝與殘留 聚醚類離子抗生素在動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛,絕大部分藥物及其代謝產(chǎn)物經(jīng)膽管排泄,最終隨糞便排出體外。其中,肝臟和脂肪殘留物濃度最高,其次為腎臟、肌肉和血漿。一般地,肝臟中主要以代謝物形式存在,脂肪中主要以原形藥物形式存在。絕大部分被吸收的PEs在肝組織內(nèi)被迅速代謝并失去活性,隨膽汁排泄。主要代謝方式是O-脫甲基,其他包括羥化、脫羧、氧化(成酮)及葡萄糖醛酸結(jié)合等[5]。馬杜霉素在火雞中的主要代謝途徑是脫一個(gè)或多個(gè)甲氧基,其次是羥化或與葡萄糖醛酸結(jié)合[8]。

Kennedy D G等[9]以含馬杜霉素5 mg/kg飼料飼喂28日齡肉仔雞14 d停藥后,連續(xù)7 d屠宰取樣測(cè)定,結(jié)果表明,停藥當(dāng)天,肝臟中馬杜霉素濃度最高(0.16 mg/kg),消除半衰期為20 h,胸肌中馬杜霉素濃度為28μg/kg,消除半衰期為39 h。休藥5 d,肝臟和胸肌中仍有馬杜霉素殘留,檢出值分別是1.6μg/kg和1.5μg/kg。

沈建忠等[10-11]用ELISA方法測(cè)定,研究了馬杜霉素在AA肉仔雞組織中的殘留消除規(guī)律。其研究認(rèn)為,馬杜霉素在脂肪和肝臟中殘留最高,其次是腎臟,肌肉殘留最小。馬杜霉素在組織中的消除速度很快,以5.0 mg/kg劑量添加于飼料中飼喂肉雞42 d,停藥2～3 d,試雞組織中馬杜霉素的殘留量已低于農(nóng)業(yè)部規(guī)定的馬杜霉素在雞組織中的最高殘留限量,但隨著添加劑量的增大,馬杜霉素在試雞各組織中的殘留量也相應(yīng)增加。

1.4 毒理學(xué)特征 馬杜霉素的中毒劑量與安全劑量非常接近,在生產(chǎn)實(shí)際中,添加過量或拌料不均引起雞中毒現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。Laczay P[12]報(bào)道,飼料中馬杜霉素的劑量達(dá)到7.5 mg/kg時(shí),可使雞增重和飼料轉(zhuǎn)化率下降。沈建忠等[10-11,13]報(bào)道,飼料中馬杜霉素的添加量超過7 mg/kg時(shí)會(huì)出現(xiàn)雞生長(zhǎng)抑制,飼料轉(zhuǎn)化率下降,死亡率上升等中毒癥狀;在研究雞馬杜霉素慢性中毒時(shí),發(fā)現(xiàn)心肌有出血和壞死,肝臟有變性和壞死。姜柏芳等[14]報(bào)道,安全預(yù)防量為每千克飼料添加不得超過5 mg,添加量超過6 mg時(shí)就會(huì)引起厭食、抑制生長(zhǎng)等輕度中毒反應(yīng),超過10 mg時(shí)就可引起軟腳,行走困難等癥狀,致死、致殘率可達(dá)10%～80%。

高劑量的PEs主要通過干擾動(dòng)物細(xì)胞的離子平衡和能量代謝而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用,細(xì)胞出現(xiàn)變性或壞死。一些對(duì)ATP依賴性強(qiáng)的組織最敏感,如心肌、膈肌等[5]。食入殘留有馬杜霉素的食物可引起人血管舒張,特別是誘發(fā)心臟冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張和血流量增加,對(duì)正常人群而言沒有明顯的不良反應(yīng),但當(dāng)患有冠狀動(dòng)脈疾病的人群,食入過多殘留有馬杜霉素的食物后,可引起冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張,心臟局部缺氧加重,使病情惡化[15]。

2 檢測(cè)分析方法

目前,國內(nèi)外關(guān)于馬杜霉素的檢測(cè)分析方法不多,主要包括：紫外分光光度法、原子吸收法、薄層色譜法、高效液相色譜法及免疫法。根據(jù)檢測(cè)目的選擇相應(yīng)檢測(cè)方法。當(dāng)對(duì)大批量藥物殘留樣品進(jìn)行篩選時(shí),簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性強(qiáng)的 ELISA方法是最佳選擇。當(dāng)測(cè)定制劑、飼料及預(yù)混劑等藥物含量較高的樣品時(shí),可選擇薄層色譜法、紫外分光光度法及液相色譜紫外檢測(cè)法。液相色譜熒光檢測(cè)法靈敏度較高,可進(jìn)行動(dòng)物組織中獸藥殘留的檢測(cè)。當(dāng)對(duì)馬杜霉素進(jìn)行確證及多殘留檢測(cè)時(shí),需采用價(jià)錢昂貴的液相質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)定。

2.1 紫外分光光度法 紫外分光光度法具有快速、簡(jiǎn)便、低成本等優(yōu)點(diǎn)。但其精確度較差,適用于樣品含量較高時(shí)測(cè)定。徐恩民[16]用甲醇稀釋,香草醛衍生,紫外分光光度法測(cè)定馬杜霉素制劑的含量,與高效液相測(cè)定結(jié)果無明顯差異。濃度在20μg/mL～45μg/mL范圍內(nèi)線性良好,回收率達(dá)到99.66%。

2.2 原子吸收法 Johnson[17]用原子吸收光譜法檢測(cè)飼料中馬杜霉素含量。樣品經(jīng)丙酮提取,氧化鋁柱凈化,二甲苯定容后標(biāo)記上Na+進(jìn)行檢測(cè)。添加濃度在1 mg/kg～8 mg/kg范圍內(nèi),該方法的平均回收率達(dá)到89.5%,檢測(cè)限為100 ng/kg～200 ng/kg。

2.3 色譜法 包括薄層色譜法和高效液相色譜法等常見方法。因馬杜霉素分子量大和多功能團(tuán)的存在,無法用GC檢測(cè),且缺乏紫外吸收和電化學(xué)特征,無法直接測(cè)定[9]。但其結(jié)構(gòu)中含有活性基團(tuán)供紫外或熒光衍生。其中,羥基和羰基在強(qiáng)酸條件與香草醛等發(fā)生羥醛縮合反應(yīng),生成具有紫外吸收的物質(zhì);半縮醛在酸性條件下與丹磺酰肼縮合成具有強(qiáng)熒光的腙衍生物[10]。熒光檢測(cè)的靈敏度較紫外高一個(gè)數(shù)量級(jí)。除此之外,液相色譜還可與質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行直接測(cè)定。

2.3.1 薄層色譜法 薄層色譜法(TLC)不要昂貴儀器,具有便利、特異等優(yōu)點(diǎn)。常作定性和半定量分析。但其靈敏度、準(zhǔn)確度不高。陳運(yùn)勤等[18]用薄層色譜法測(cè)定組織中馬杜霉素的殘留,樣品經(jīng)過丙酮簡(jiǎn)單提取,香草醛濃硫酸甲醇溶液顯色,薄層掃描儀上掃描定量。該方法的檢測(cè)限在0.8 g以下,線性范圍為1～8 g的相關(guān)系數(shù)在0.97以上。莫能菌素、鹽霉素不會(huì)干擾測(cè)定。

2.3.2 液相色譜法 液相色譜儀可以與紫外檢測(cè)器(UV)、熒光檢測(cè)器(FLD),質(zhì)譜(MS)等檢測(cè)器聯(lián)用進(jìn)行馬杜霉素的測(cè)定。通常采用C18色譜柱進(jìn)行分離。紫外檢測(cè)常以磷酸-甲醇溶液為流動(dòng)相,熒光常以硫酸氫化四丁胺-乙腈溶液為流動(dòng)相,液相質(zhì)譜則采用水-乙腈為流動(dòng)相。

Jong J D等[19]采用反相液相色譜法測(cè)定飼料和預(yù)混劑中馬杜霉素的含量。樣品經(jīng)甲醇提取,香草醛柱后衍生,紫外520 nm處檢測(cè)。該方法的回收率在90%以上,檢測(cè)限是2 mg/kg,飼料(1 mg/kg～5 mg/kg)和預(yù)混劑(500 mg/kg)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7～7.7%間。此方法還可用于莫能菌素、甲基鹽霉素、鹽霉素的測(cè)定。Gliddon M J等[20]用二氯甲烷-乙腈提取,丹磺酰肼柱前衍生,florisil柱凈化,測(cè)定雞飼料中的馬杜霉素銨。該方法在0～1.6 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995,平均回收率為99%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.0%。同年,Markantonatos A[21]用乙腈提取飼料和預(yù)混劑中馬杜霉素銨的含量,其余方法同于Gliddon M J。該方法在線性范圍0.2μg/kg～10.0μg/kg的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999 88?；厥章试?4.8%～112.9%之間,平均回收率為 98.0%,變異系數(shù) 9.2%。Dubuis M[22]采用液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測(cè)定肌肉和雞蛋中包括馬杜霉素在內(nèi)的九種抗球蟲藥。樣品經(jīng)乙腈提取,硅膠固相萃取小柱凈化,C18色譜柱分離,流動(dòng)相為一定比例的水和乙腈,并進(jìn)行梯度洗脫。采用電噴霧電離源,[M+Na]+進(jìn)行監(jiān)測(cè),馬杜霉素的回收率為52%。

3 免疫檢測(cè)方法

免疫檢測(cè)方法是利用抗原與抗體在體外的特異性反應(yīng)建立起來的檢測(cè)技術(shù),具有高選擇性、高靈敏度等特點(diǎn)。常用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。

馬杜霉素屬于小分子物質(zhì)(分子量為934),沒有免疫原性,必須與大分子載體物質(zhì)(如牛血清白蛋白)進(jìn)行偶聯(lián)成人工抗原才能獲得免疫原性,才能使動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗馬杜霉素的抗體。在此基礎(chǔ)上建立了酶聯(lián)免疫法測(cè)定馬杜霉素的含量。

沈建忠等[10]發(fā)現(xiàn)馬杜霉素分子羧基上連接一個(gè)6個(gè)碳分子后再與卵清蛋白結(jié)合成的包被抗原(M-C6-OVA),能大大提高ELISA檢測(cè)靈敏度。首次制備針對(duì)馬杜霉素特異性的高容量免疫親和色譜柱,能滿足馬杜霉素殘留分析的要求。樣品添加回收率達(dá)到76.4%～107.5%,變異系數(shù)為3.8%～16.4%,檢測(cè)限為 1.0μg/kg～2.8μg/kg。說明IAC-ELISA方法的靈敏性和可靠性均達(dá)到殘留檢測(cè)的要求,而且此方法未發(fā)現(xiàn)馬杜霉素抗血清對(duì)基本結(jié)構(gòu)相識(shí)的莫能菌素、鹽霉素、拉傻洛菌素和甲基鹽霉素同屬聚醚類抗生素有交叉反應(yīng),說明此方法具有較高的親和性和選擇性。

4 分析聯(lián)用技術(shù)

各種分析技術(shù)聯(lián)用是現(xiàn)代獸藥殘留分析乃至整個(gè)分析化學(xué)方法的發(fā)展方向,聯(lián)用技術(shù)可以取長(zhǎng)補(bǔ)短,獲得單一分析技術(shù)難以達(dá)到的效果,如：免疫分析-液相色譜(IAS-HPLC)。

2002年,項(xiàng)新華等[23]建立了用丙酮提取,免疫親和層析柱純化,丹磺酰肼衍生,以C18色譜柱分離,乙睛-硫酸氫四丁胺溶液為流動(dòng)相,λex=220 nm、λem=520 nm熒光檢測(cè)兔可食組織中馬杜霉素殘留量,在0.1μg/g～2.0μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r為0.999 52;各組織樣品的平均回收率在80%左右。該方法具有 IAC高度特異性與HPLC極高分辨率的雙重特點(diǎn),免疫親和層析純化動(dòng)物組織中馬杜霉素,不必使用大量有機(jī)溶劑,過程簡(jiǎn)單,最大限度地消除雜質(zhì)引起的非特異性反應(yīng)和交叉反應(yīng),從而提高了檢測(cè)限和回收率。

5 小結(jié)

馬杜霉素作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用于雞球蟲病的預(yù)防。但添加劑量與中毒劑量非常接近。添加過量或不遵守休藥期均可導(dǎo)致藥物在組織中的殘留,建立靈敏的檢測(cè)方法保障動(dòng)物源性食品安全勢(shì)在必行。

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