邵美麗,劉思國(guó)
(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所,黑龍江哈爾濱150001;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱150030)
豬傳染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的一種以肺的急性出血、壞死和慢性纖維素性胸膜肺炎為主要特征的高度接觸性呼吸道傳染病。該病可致各年齡段的豬只發(fā)生急性和慢性感染,最高死亡率可達(dá) 80%~100%[1]。自1957年首次報(bào)道本病以來(lái),本病幾乎遍及世界所有養(yǎng)豬國(guó)家,且流行日趨嚴(yán)重,已成為世界性規(guī)模化養(yǎng)豬的重要疫病之一[2]。因此,研發(fā)高效、安全的APP疫苗成為預(yù)防和控制本病蔓延的根本。而在研發(fā)疫苗的保護(hù)效果評(píng)價(jià)方面,大多以動(dòng)物的存活率、抗體的產(chǎn)生情況、臟器的損傷情況為評(píng)價(jià)指標(biāo)[3-5]。但這些指標(biāo)均不能直接反映疫苗對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物靶器官抗原的清除情況,也不能直接體現(xiàn)靶器官抗原的分布情況。故本課題組采用間接免疫熒光抗體法對(duì)免疫攻毒后小鼠靶器官-肺臟中的APP抗原進(jìn)行了定位,比較了滅活疫苗和重組亞單位疫苗對(duì)小鼠肺臟中APP抗原的清除能力。同時(shí)與各組小鼠的存活率及其肺臟的病理學(xué)變化進(jìn)行相關(guān)性比較。該方法的應(yīng)用不僅為跟蹤定位 APP抗原在動(dòng)物體內(nèi)的分布奠定基礎(chǔ),同時(shí)為更加直接、深入評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果提供新的思路。
1.1 菌株 APP1型72-1株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌病研究室提供。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡雄性BALB/c小鼠,購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院。
1.3 抗體 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自Sigma公司,兔抗APP1型陽(yáng)性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌病研究室提供。
1.4 疫苗 APP1型滅活疫苗和重組亞單位疫苗(重組蛋白rApx I+rApxⅡ+rApx III+rOMP)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所細(xì)菌病研究室自行制備。
1.5 免疫攻毒及樣品采集 將小鼠分成對(duì)照組、滅活疫苗組和重組亞單位疫苗組,背部皮下多點(diǎn)注射,每2周免疫1次,共3次。3免1周后,采用5LD50劑量,通過(guò)滴鼻攻 APP1型菌。攻毒5 d后,將存活小鼠剖殺,分離肺臟,備用。
1.6 間接免疫熒光抗體法定位肺臟中 APP抗原 用冰凍切片機(jī)將冰凍好的肺臟組織切成4μm厚的薄片,并將其粘附于載玻片上。待其自然干燥。滴加預(yù)冷的丙酮固定5 min。用0.01 mol/L p H值7.4 PBS洗滌3次,自然干燥。滴加兔抗 APP1型菌的陽(yáng)性血清(1∶40稀釋),同時(shí)以未免疫小鼠的血清作陰性對(duì)照。玻片置于濕盒中,37℃孵育45 min。用0.01 mol/L p H 值7.4 PBS沖洗后,在裝有0.01 mol/L p H值7.2 PBS液的3個(gè)缸內(nèi)依次浸泡,每個(gè)缸浸泡5 min,期間不時(shí)振蕩幾次。玻片從玻缸取出后,用濾紙吸干,滴加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(1∶100稀釋,且含0.01%伊文思藍(lán))。將玻片置于濕盒中,37℃孵育45 min,洗滌3次。晾干后,用碳酸甘油封片,于熒光顯微鏡下觀察。
1.7 肺臟的病理組織切片的制備 將小鼠的肺臟,經(jīng)10%緩沖液福爾馬林固定后,常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木精-伊紅染色,制備病理組織切片[6]。
2.1 免疫攻毒后各組小鼠肺臟中 APP抗原的分布情況 熒光檢測(cè)顯示,對(duì)照組小鼠攻毒后,肺泡及其間質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)閃亮熒光團(tuán),且團(tuán)塊較大、數(shù)量較多。滅活苗組也有熒光團(tuán)出現(xiàn),但亮度、大小明顯小于對(duì)照組,數(shù)量也明顯少于對(duì)照組。重組亞單位疫苗組則無(wú)明顯熒光團(tuán)出現(xiàn),只見(jiàn)微弱的散在的熒光點(diǎn),具體見(jiàn)表1、中插彩版圖1。
表1 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
2.2 免疫攻毒后各組小鼠的存活情況 免疫攻毒后,對(duì)照組小鼠全部死亡。滅活疫苗組存活率為60%(6/10)。重組亞單位疫苗組存活率為90%(9/10)。
2.3 免疫攻毒后各組小鼠肺臟的病理學(xué)變化情況 剖檢顯示,對(duì)照組小鼠肺臟顏色發(fā)黑,且有嚴(yán)重出血、壞死,損傷面積達(dá)90%以上。滅活疫苗組小鼠肺臟有中度出血、壞死,損傷面積達(dá)25%~35%。重組亞單位疫苗組小鼠肺臟無(wú)明顯病變(見(jiàn)中插彩版圖2)。
病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組小鼠肺臟有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),出血嚴(yán)重,肺泡內(nèi)漿液性、纖維素性滲出且伴有大量脫落的肺泡上皮細(xì)胞,肺泡膈細(xì)胞變性、壞死、核濃縮,大部分肺泡崩解而造成實(shí)變。滅活疫苗組有中度出血,氣管周圍有炎性細(xì)胞、灶狀浸潤(rùn)。肺泡漿液性、纖維素性滲出、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且部分肺泡裂解,形成實(shí)變。重組亞單位疫苗組無(wú)明顯病變,只有血管周圍有輕度水腫,個(gè)別肺泡內(nèi)有少量的漿液性滲出(見(jiàn)中插彩版圖3)。
間接免疫熒光抗體法是免疫熒光技術(shù)中的一種。該方法通過(guò)熒光素標(biāo)記二抗的結(jié)合,將信號(hào)進(jìn)行放大,在一定程度上提高了檢測(cè)的靈敏度。因其直觀性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)便成為實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)菌、病毒快速檢測(cè)及臨床疾病的快速診斷的手段。不僅如此,由于其能夠直觀地應(yīng)用熒光顯微鏡觀察到抗原在組織器官內(nèi)細(xì)胞水平的確切分布和定位,也成為研究病原致病機(jī)理的有效手段[7-9]。也正是基于這個(gè)原理,本研究嘗試將間接免疫熒光抗體法定位組織器官內(nèi)的抗原與疫苗的保護(hù)效果結(jié)合起來(lái),這不僅為間接免疫熒光抗體法的更廣泛應(yīng)用提供依據(jù),同時(shí)也為評(píng)價(jià)疫苗的保護(hù)效果提供新的思路。
本研究采用間接免疫熒光法定位了免疫攻毒后的各組小鼠肺臟中的APP。結(jié)果顯示,滅活疫苗組和重組亞單位疫苗組小鼠肺臟中熒光強(qiáng)度、數(shù)量均明顯弱于對(duì)照組。重組亞單位疫苗組的熒光強(qiáng)度又明顯弱于滅活疫苗組。這說(shuō)明滅活疫苗和重組亞單位疫苗均對(duì)APP抗原起到了一定的清除和中和作用,且重組亞單位疫苗組對(duì)APP抗原的清除和中和能力最強(qiáng)。因此初步判定,重組亞單位疫苗的保護(hù)效果優(yōu)于滅活疫苗組。將該判定結(jié)果與各組小鼠的存活率及其肺臟的病理學(xué)損傷進(jìn)行相關(guān)性比較,發(fā)現(xiàn)它們?nèi)呔哂幸恢滦?即重組亞單位疫苗組和滅活疫苗組小鼠的存活率及其肺臟的病理學(xué)損傷均弱于對(duì)照組,且重組亞單位疫苗組小鼠的存活率及其肺臟的病理學(xué)損傷又明顯弱于滅活疫苗組。因此我們認(rèn)為,通過(guò)間接免疫熒光定位法攻毒后小鼠肺臟中的APP抗原作為疫苗保護(hù)效果的一種評(píng)價(jià)手段是可行的。
[1] 張立昌.豬傳染性胸膜肺炎研究進(jìn)展[J].養(yǎng)豬,2001(1):40-42.
[2] 陳小玲,楊旭夫,朱士盛.豬傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制措施[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2001,37(7):33-35.
[3] Fenwick B W,Henry S.Porcine pleuropneumonia[J].J Am Vet Med Assoc,1994,204(9):1334-1340.
[4] Hensel A,Huter V,Katinger A,etal.Intramuscular immunization with genetically inactivated(ghosts)Actinobacillus pleuropeneumoniae serotype 9 protects pigs against homologous aerosol challenge and prevents carrier state[J].Vaccine,2000,18(26):2945-2955.
[5] van DBH,Frey J.Interference of outer membrane protein Pal A with protective immunity against Actinobacillus pleuropneumoniae infections in vaccinated pigs[J].Vaccine,2003,21(25~26):3601-3607.
[6] 陳興若,陶祥洛.病理切片制備技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1995.
[7] 張舍郁,程安春,汪銘書,等.間接免疫熒光檢測(cè)石蠟切片中鴨腫頭出血癥病毒及抗原定位方法的初步建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(3):868-874.
[8] 程安春,韓曉英,朱德康,等.間接免疫熒光染色檢測(cè)石蠟切片中的鴨病毒性腸炎病毒和抗原定位[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,28(8):871-875.
[9] 劉思國(guó),尹訓(xùn)南,李廣興,等.間接免疫熒光抗體法對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒進(jìn)行抗原定位[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000,22(9):82-85.