張 靜

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

熊果酸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

張 靜

(長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討熊果酸對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制。方法：運(yùn)用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡率；Western blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C(cytochrome c，cyt-c)、caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：熊果酸對(duì)HepG2細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性；細(xì)胞主要阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少；同時(shí)cyt-c釋放和caspase-3酶原活化增加。結(jié)論：熊果酸能夠在體外抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而促進(jìn)cyt-c釋放增加，引起caspase-3的活化可能是其作用機(jī)制之一。

熊果酸；HepG2；細(xì)胞色素C；Caspase-3

熊果酸(Ursolic acid，UA)，又名烏索酸、烏蘇酸，是一種五環(huán)三萜酸類化合物，在自然界中分布廣泛，如在熊果、枇杷葉、女貞子、山楂、車前子、夏枯草和白花蛇舌草等天然植物中。它具有抗炎、護(hù)肝、止痛、降血糖、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)[1]，其中最為突出的是抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，UA既能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，又能抑制正常細(xì)胞的惡變，有望成為抗腫瘤新藥。目前已證實(shí)它能通過多種機(jī)制誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MGF-7、肺癌細(xì)胞A529、前列腺癌pc-3、胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC、大腸癌細(xì)胞-HT29、子宮內(nèi)膜癌SNG-Ⅱ等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[2]；也能通過胞漿內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的移位下調(diào)人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞MMP9基因的表達(dá)，從而降低腫瘤的侵襲力[3]。本研究用UA處理人肝癌細(xì)胞HepG2，觀察細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因的改變，為熊果酸在抗腫瘤臨床應(yīng)用及其作用機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株HepG2購自上海細(xì)胞所；RPMI-1640購自Gibco BRL公司；熊果酸、MTT、Hoechst33258熒光染料和PI染料均購自美國Sigma公司；鼠抗人cyt-c，caspase-3單抗購自Chemicon公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104個(gè)/ml，每孔200l接種于96孔培養(yǎng)板，孵育24h后，每孔加入不同藥物濃度的UA使終濃度分別為20、40、60和80mol/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；另設(shè)對(duì)照組(0mol/L)。分別于加藥后24，48和72h檢測(cè)細(xì)胞活動(dòng)。細(xì)胞孵育終止前，每孔加入MTT使其終濃度為1mg/ml，4h后離心棄上清，每孔加入DMSO 100μl溶解結(jié)晶，混勻后置于酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度(D)。計(jì)算增殖抑制率IR(%)=[(1-實(shí)驗(yàn)組光密度值)/對(duì)照組光密度值]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的改變 用終濃度40mol/L的UA作用HepG2細(xì)胞24，48，72h，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(0mol/L)。每組收集2×106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的70%乙醇固定12h；離心棄固定液，PBS重懸5min后300目篩網(wǎng)過濾；加入PI染液，4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀(Beckman)分析細(xì)胞周期及凋亡率。

1.2.4 Western blotting 分別用終濃度0，20，40，60和80mol/L UA作用于細(xì)胞48h，每組收集1×107個(gè)細(xì)胞；分別加入120μl蛋白裂解液在冰浴中裂解30min后，4℃離心并收集上清；取約25μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后取凝膠，于4℃下電流60mA轉(zhuǎn)印過夜至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉封閉1h后，依次加第一抗體鼠抗人cyt-c(鼠抗人caspase-3)單抗和第二抗體HRP-羊抗鼠(羊抗兔)IgG，各孵育1h，DAB顯色液顯色并攝像、保存。

2 結(jié) 果

2.1UA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用UA呈劑量和時(shí)間依賴性的抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖(見表1)。20mol/L UA對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用相對(duì)較弱，而 80mol/L UA作用72h后，HepG2細(xì)胞幾乎停止增殖。

表1不同濃度UA抑制HepG2細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)作用

注：與對(duì)照組比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01。

2.2UA對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響經(jīng)40mol/L UA作用24,48,72h后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞的比例逐漸上升，S期細(xì)胞的比例逐漸下降，主要呈現(xiàn)G0/G1期阻滯，并存在時(shí)間依賴性。見表2。

表2 UA對(duì)HepG2細(xì)胞周期和凋亡率的影響 %

注：與對(duì)照組比較，*Plt;0.05。

2.3Westernblotting結(jié)果用20～80mol/L UA處理細(xì)胞48h后，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞色素C(15kD)的蛋白條帶逐漸加深(見圖1)。還可以檢測(cè)到約caspase-3(32kD)酶原活化，棕黃色蛋白條帶逐漸變淺變細(xì)；而活化片段(17kD和19kD)的蛋白條帶顏色則逐漸加深(見圖2)。

1～5：0,20，40，60和80mol/L UA 1～5：0，20，40，60和80mol/L UA 圖1 Western blotting檢測(cè)UA作用后cyt-c表達(dá) 圖2 Western blotting檢測(cè)UA作用后caspase-3表達(dá)

3 討 論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居我國惡性腫瘤死亡率的第二位。雖然目前外科手術(shù)仍是治療肝癌的最有效手段，但適于手術(shù)切除的肝癌不足25%，而且術(shù)后5年生存率僅為40%[4]。因此，為肝癌患者尋找更多、更有效的治療手段變得越來越迫切。大量報(bào)道表明熊果酸具有廣泛的藥理作用，它能通過抑制腫瘤形成、細(xì)胞毒作用、生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成以及增強(qiáng)免疫功能等多種機(jī)制來抑制腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散；而且其安全性能高、不良反應(yīng)少，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，有望成為一種高效低毒的抗腫瘤新藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，UA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有明顯的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性。應(yīng)用80mol/L熊果酸處理HepG2細(xì)胞72h后，其增殖抑制率最高達(dá)到89.22%。細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)UA主要將肝癌HepG2細(xì)胞阻滯在G0/G1期，而S期細(xì)胞逐漸減少。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，UA阻滯細(xì)胞周期的作用逐漸增強(qiáng), 呈顯著的時(shí)間依賴性。這一結(jié)果提示：熊果酸可能直接損傷DNA，通過阻滯細(xì)胞G0/G1期，使細(xì)胞堆積在DNA合成前期，無法進(jìn)入DNA合成期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，caspases的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)控制著凋亡的發(fā)生與發(fā)展[5]。Caspases級(jí)聯(lián)發(fā)應(yīng)的激活主要通過兩條途徑：一條是外源性途徑[6]即死亡受體途徑，另一條是內(nèi)源性途徑[7]即線粒體依賴途徑。本實(shí)驗(yàn)主要是從線粒體依賴途徑方面研究。Western blotting的結(jié)果顯示，隨著熊果酸作用濃度的增加，細(xì)胞色素C的條帶顏色逐漸加深，說明其釋放量逐漸增多，同時(shí)我們還檢測(cè)到caspase-3酶原被活化，裂解成兩個(gè)活性片段(17kD和19kD)。我們認(rèn)為，細(xì)胞色素C從線粒體釋放是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，釋放到細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，形成細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合體，該復(fù)合體可使無活性的caspase-9酶原發(fā)生自身活化，繼而形成細(xì)胞色素C/Apaf-1/caspase-9 復(fù)合體，此復(fù)合體繼續(xù)作用于下游的效應(yīng)caspases如caspase-3等?；罨腸aspase-3可以作用于胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架蛋白，或作用于細(xì)胞核中的DNA酶,引起DNA斷裂，從而引發(fā)了HepG2細(xì)胞的凋亡[8]。

綜上所述，促進(jìn)cyt-c的釋放，進(jìn)一步激活caspase-3可能是熊果酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一，當(dāng)然為了更加肯定這個(gè)結(jié)論，我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)caspase-9、Apaf-1等。但由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)多系統(tǒng)、多階段參與的復(fù)雜過程[9]，熊果酸在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響尚有待進(jìn)一步研究。

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[編輯] 一 凡

2010-11-20

張靜(1981-)，女，湖北沙市人，講師，碩士，從事分子生物學(xué)教學(xué)與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.04.002

R735.7

A

1673-1409(2010)04-R004-03