石金鳳 莫中成 謝遠(yuǎn)杰 黃欣瓊 李美香 龍治峰 賀麗萍

目前對(duì)隱睪患者的治療方案主要是盡早行隱睪固定術(shù),但手術(shù)并不能使所有的隱睪患者完全恢復(fù)正常的生育能力。男性隱睪癥患者和實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物隱睪模型中,生精細(xì)胞大量凋亡造成雄性個(gè)體生殖力下降[1]。已有研究表明一氧化氮(NO)是使實(shí)驗(yàn)性隱睪生精細(xì)胞過度凋亡的重要物質(zhì),為了進(jìn)一步闡明隱睪復(fù)位后不育的機(jī)理,本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠隱睪下降固定模型,觀察生精細(xì)胞凋亡情況與一氧化氮合酶(NOS)表達(dá)的變化,為從 NO途徑治療由生精細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的不育和提高隱睪患者術(shù)后生育力提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、動(dòng)物模型的建立

45只健康雄性 SD大鼠(22日齡)隨機(jī)分為隱睪組(30只)和假手術(shù)組(15只)。按參考文獻(xiàn)[2]方法建立右側(cè)隱睪模型：戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉,下腹正中切口,隱睪組大鼠切斷右側(cè)睪丸引帶,用 7-0無創(chuàng)傷線將右側(cè)睪丸固定于腹后壁關(guān)腹;假手術(shù)組是將右側(cè)睪丸切斷引帶后還納入陰囊關(guān)腹。術(shù)后 12天將隱睪組大鼠隨機(jī)均分為隱睪對(duì)照組和隱睪固定組,隱睪對(duì)照組不做處理,隱睪固定模型建立按參考文獻(xiàn)[3]操作。術(shù)后第 24天脫頸椎處死大鼠,取血清于 -80℃凍存,硝酸還原酶法測定血清 NO含量,化學(xué)比色法測血清 NOS活性,原位末端標(biāo)記法(TUNEL)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測 3組大鼠右側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡情況,Western blot和免疫組化分別檢測內(nèi)皮型NOS(eNOS)、誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)蛋白表達(dá)的變化。

二、試劑及儀器

兔抗鼠 eNOS IgG、兔抗鼠 iNOS IgG、SABC免疫組化試劑盒及細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均由武漢博士德公司生產(chǎn);NO檢測試劑盒、NOS檢測試劑盒由南京建成生物工程公司生產(chǎn);流式細(xì)胞儀(EPICS-XL)為美國 Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.NO含量及 NOS活性檢測 用硝酸還原酶法檢測血清 NO含量,采用化學(xué)比色法測定睪丸組織中NOS活性,操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.生精細(xì)胞凋亡檢測及 DNA分析 ①TUNEL法檢測生精細(xì)胞凋亡：取各組大鼠右側(cè)睪丸組織石蠟包埋切片后按照試劑盒說明書操作,光鏡下胞核著棕黃色者為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞;陽性對(duì)照是已知有大量凋亡細(xì)胞的小腸切片(由公司提供);陰性空白對(duì)照未加 TUNEL反應(yīng)液。每個(gè)睪丸組織切片觀察10個(gè)生精小管橫斷面,平均每個(gè)生精小管橫斷面的凋亡細(xì)胞數(shù)即為凋亡指數(shù)(AI)[4]。②流式細(xì)胞術(shù)測定生精細(xì)胞凋亡：每組取 6份 0.25cm×0.25cm大小右側(cè)睪丸組織置于培養(yǎng)皿上的 240目不銹鋼篩網(wǎng)內(nèi),用眼科組織剪將睪丸組織剪碎,用注射器的針芯輕搓組織塊,邊搓邊滴加生理鹽水,直到組織搓完,收集細(xì)胞懸液,離心(1000r/min×8min),70%乙醇固定制成單細(xì)胞懸液,處理后上機(jī)分析。

3.Western blot和免疫組化 SABC法檢測 eNOS、iNOS蛋白 將 3組大鼠右側(cè)睪丸組織裂解,提取組織蛋白,BCA試劑測定總蛋白含量,β-actin作為內(nèi)對(duì)照,蛋白樣品經(jīng) SDS-PAGE,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合,熒光顯影,掃描分析。取 3組大鼠右側(cè)睪丸組織按照免疫組化 SABC試劑盒說明書操作,檢測eNOS、iNOS蛋白含量,陰性對(duì)照用磷酸緩沖液代替一抗,含這兩種蛋白的細(xì)胞應(yīng)呈棕黃色。

四、數(shù)據(jù)處理

計(jì)量資料均采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)組間均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析。

結(jié) 果

一、NO含量及 NOS活性檢測

隱睪對(duì)照組的血清 NO濃度(80.98±4.01μmol/L)、NOS活性(45.81±1.65 U/ml)明顯高于隱睪固定組(60.59±4.33μmol/L、27.62±0.56 U/ml)和假手術(shù)組(38.70±5.65μmol/L、16.53±0.26 U/ml),P＜0.01;而隱睪固定組這兩個(gè)指標(biāo)又高于假手術(shù)組(P＜0.05)。

二、TUNEL法對(duì)生精細(xì)胞凋亡的檢測

如圖 1所示,3組睪丸內(nèi)均可見到胞核為棕黃色凋亡的生精細(xì)胞,包括初級(jí)精母細(xì)胞和精原細(xì)胞,未見支持細(xì)胞呈陽性反應(yīng)。隱睪對(duì)照組睪丸生精小管內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,凋亡指數(shù)(29.37±1.02)明顯高于隱睪固定組(14.58±2.98)和假手術(shù)組(2.06±1.02),P＜0.01;隱睪固定組則明顯小于假手術(shù)組(P＜0.05)。

三、FCM檢測大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡

如圖 2所示,3組大鼠生精細(xì)胞在 G1期前端均出現(xiàn)了一個(gè)稱之為凋亡峰的亞倍體峰,顯示各組大鼠右側(cè)睪丸細(xì)胞凋亡率假手術(shù)組為(7.25±1.02)%,隱睪固定組為(23.56±3.42)%,均明顯低于隱睪對(duì)照組(32.98±3.41)%,P＜0.05;而假手術(shù)組又低于隱睪固定組(P＜0.05)。

四、免疫組化檢測 eNOS、iNOS蛋白表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示,3組大鼠右側(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞內(nèi)均有 eNOS表達(dá)(圖 3A,B),假手術(shù)組睪丸生精上皮僅見 eNOS的弱表達(dá),隱睪固定組右側(cè)睪丸生精上皮中有較強(qiáng)的 eNOS表達(dá),以初級(jí)精母細(xì)胞為主。各組大鼠右側(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞均有 iNOS表達(dá),而血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞均無 iNOS表達(dá)(圖 3C,D),假手術(shù)組右側(cè)睪丸生精上皮可見iNOS的弱表達(dá),隱睪固定組右側(cè)睪丸生精上皮中可見到較強(qiáng)的 iNOS表達(dá)。

五 、Western blot檢測 eNOS、iNOS蛋白表達(dá)

如圖 4所示,隱睪固定組 eNOS、iNOS蛋白表達(dá)量均增高,約分別為假手術(shù)組的 2.4倍(P＜0.01)、3.3倍(P＜0.01),隱睪固定組和假手術(shù)組表達(dá)均無差別(P＞0.05)。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過 SD雄性大鼠手術(shù)建立右側(cè)隱睪模型,術(shù)后 12天再建立隱睪下降固定模型。隱睪模型大鼠手術(shù)側(cè)睪丸內(nèi)生精上皮變薄,生精細(xì)胞排列紊亂,生精細(xì)胞凋亡明顯增加;隱睪固定模型,大鼠手術(shù)側(cè)睪丸生精小管內(nèi)生精細(xì)胞排列有序,凋亡的生精細(xì)胞減少;假手術(shù)組睪丸生精小管內(nèi)可見到各級(jí)生精細(xì)胞且細(xì)胞排列有序,只見散在的少量凋亡生精細(xì)胞。說明實(shí)驗(yàn)性隱睪導(dǎo)致了生精細(xì)胞的大量凋亡,隱睪下降固定能明顯減少生精細(xì)胞凋亡,促進(jìn)生精功能的改善,但在隱睪下降固定后的短時(shí)間內(nèi)比正常睪丸生精細(xì)胞凋亡率高。Matsuki等[5]研究發(fā)現(xiàn)高位型隱睪固定術(shù)患者的睪丸活檢均為重度受損,雙側(cè)隱睪即使早期治療,不育率仍超過 60%,單側(cè)隱睪不育率達(dá)25%[6]。因此,隱睪會(huì)使睪丸生精細(xì)胞凋亡增加,隱睪下降固定能通過減少生精細(xì)胞凋亡而改善生精功能,部分隱睪固定術(shù)后仍不能完全恢復(fù)生育能力可能與生精細(xì)胞凋亡仍較正常睪丸高有關(guān)。

NOS是由兩個(gè)分子量為 130-160kDa的相同單體組成的同型二聚體,在體內(nèi)有 eNOS、神經(jīng) NOS型(nNOS)和 iNOS 3種同工酶,能催化左旋精氨酸脫胍基產(chǎn)生信使分子 NO和左旋瓜氨酸。NO脂溶性很強(qiáng),極易通過生物膜作用于各種靶細(xì)胞,激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷酸(cGMP)水平升高而發(fā)揮信使和效應(yīng)分子的作用。NO的作用效應(yīng)是雙向的,低濃度 NO對(duì)很多組織器官起保護(hù)作用,而高濃度 NO作為一種活性氧類,除了可直接損傷 DNA、上調(diào) p53等凋亡相關(guān)基因表達(dá)、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡外[7],也可以通過與呼吸鏈中的鐵硫鍵結(jié)合,導(dǎo)致呼吸鏈?zhǔn)軗p,產(chǎn)生活性氧,進(jìn)一步損傷線粒體,同時(shí)使線粒體跨膜電位降低,鈣泵活性喪失,胞質(zhì)鈣離子濃度顯著增加,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔形成,釋放細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子如細(xì)胞色素 C和凋亡蛋白酶活化因子 -1,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。

NOS廣泛存在于睪丸、附睪、輸精管等組織中[9]。在對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠隱睪的研究中發(fā)現(xiàn),隱睪組織中 NO濃度較對(duì)側(cè)睪丸顯著增高,此時(shí)隱睪生精細(xì)胞的 AI較對(duì)側(cè)高出 2.4倍[10],說明 NO濃度升高可能是隱睪睪丸生精細(xì)胞凋亡增加的重要原因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隱睪組織中 NOS活性顯著增加,而且 NOS升高與睪丸生精細(xì)胞的凋亡呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：隱睪對(duì)照組血清中 NO濃度、NOS活性以及生精細(xì)胞凋亡率最高,隱睪固定組則高于假手術(shù)組。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)隱睪固定組中 eNOS和 iNOS含量高于假手術(shù)組,免疫組化結(jié)果顯示在假手術(shù)組睪丸生精上皮中僅有 eNOS和 iNOS的弱表達(dá),而在隱睪固定組生精上皮中兩者均有較強(qiáng)表達(dá),說明隱睪中NOS活性增加,NO產(chǎn)生增多,凋亡增加,下降固定后NOS活性降低但仍比正常高,睪丸內(nèi) eNOS及 iNOS基因表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合文獻(xiàn)說明,盡管隱睪固定后 NO的產(chǎn)生較隱睪時(shí)低,但 NO濃度及 eNOS和 iNOS基因表達(dá)仍較正常高,局部高濃度的 NO是導(dǎo)致生精細(xì)胞仍然過度凋亡的重要原因。這為臨床隱睪患者術(shù)后生育力的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Yin Y,Hawkins KL,Dewolf WC,et al.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice.J Andrology,1997,18(2)：159 ～165.

2 賴瓊,賀麗萍,謝遠(yuǎn)杰,等.p 38MAPK在 SD大鼠隱睪中的表達(dá).中國計(jì)劃生育學(xué)雜志,2004,12(11)：735～737.

3 鄭航,鄭新民,李世文,等.大鼠隱睪、隱睪下降固定對(duì)生殖細(xì)胞發(fā)育、凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.中華小兒外科雜志,2002,23(4)：253～255.

4 Young KA,Zirkin BR,Nelson RJ.Testicular regression in response to food restriction and short photoperiod in white-footed miceis mediated by apoptosis.Biol Reprod,2000,62(2)：347～ 354.

5 Matsuki S,Iushi Y,Ikeda Y,et al.Suppression of cytochrome c release and apoptosis in testes with heat stress by minocycline.Biolchem Biophys Res Commun,2003,312(3)：843～ 849.

6 Hikim AP,Lue Y,Yamamoto CM,et al.Key Apoptotic Pathways for Heat-Induced Programmed Germ Cell Death in the Testis.Endocrinology,2003,144(7)：3167～ 3175.

7 李正,王慧貞,吉士俊.實(shí)用小兒外科學(xué).人民衛(wèi)生出版社,2001：1.

8 Lue YH,Hikim AP,Swerdloff RS,et al.Singleexposure to heat induces stage specific germ cell apoptosis in rats：Role of intratesticular testosterone on stage specificity.Endocrinology,1999,140(4)：1709～ 1717.

9 Burnett AL,Ricker DD,Tillman SL,et al.Localization of Nitric Oxide Synthase in the reproductive organs of the male rat.Biol Reprod,1995,52(1)：1～7.

10 El-Gohary M,Awara WM,Hassar S,et al.Deltamethrin-induced testicular apoptosisin rats：the protective effect of nitricoxide synthase inhibitor.Toxicology,1999,132(1)：128.