武蓉珍 劉勝勇 陳東紅 周美青 金卓杏 張曉蘭 陳曉方 周麗紅 周鐵麗

解脲支原體(UU)是人類泌尿生殖道內(nèi)最常見的支原體,可分為 14個血清型。由于各血清型之間具有較高的抗原同源性,交叉反應(yīng)明顯,給 UU臨床分離株的血清分型工作及篩選有毒力的血清型株帶來一定的困難,而不同生物群之間的交叉反應(yīng)較少見。2002年,Robertson等[1]根據(jù)UU兩個生物群的表型和基因型特征,建議將兩者劃分為脲原體屬下兩個完全獨(dú)立的物種,提出了生物群概念。生物群 1(或 Parvo生物型)包括血清型 1,3,6和 14共計 4種含較小基因(DNA長度 0.75～0.76Mbp)的 UU,生物群 2(或 T960生物型)則包括血清型 2,4,5,7,8,9,10,11,12和 13共 10種含較大基因(DNA長度0.88～1.2Mbp)的UU。近年來,解脲支原體的檢出率不斷上升,臨床上常常對宮頸分泌物、精液和前列腺液中檢測出 UU的就醫(yī)者盲目投以大量抗生素藥物,導(dǎo)致UU臨床分離株的耐藥性日益嚴(yán)重。生殖系統(tǒng)UU的致病性如何,UU是否只有某些生物群達(dá)到一定濃度時,才能影響精子的授精能力和胚胎的發(fā)育,從而致病,目前尚無一個系統(tǒng)的、有說服力的研究來證實(shí)這一點(diǎn)。人類配子的受精、卵裂、2～8細(xì)胞期的胚胎發(fā)育都在輸卵管中完成,此時若受到 UU感染將會對受精、卵裂及隨后的早期胚胎發(fā)育有何影響尚不明了。針對這一現(xiàn)象,我們用血清型 3型 UU代表含有較小基因的生物群 1(或 Parvo生物型),血清型 8型UU代表含有較大基因的生物群 2(或 T960生物型),分別與 ICR小鼠精子、成熟卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體共孵育,觀察不同生物群別的 UU對小鼠成熟卵母細(xì)胞體外受精(IVF)及卵裂的影響。

材料與方法

一、標(biāo)準(zhǔn)菌株及動物

解脲支原體血清型 3型(菌株號：ATCC27815)、血清型 8型(菌株號：ATCC27618)標(biāo)準(zhǔn)菌株購于南京東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室,傳代后 -80℃凍存?zhèn)溆?。清潔級ICR小鼠,雌鼠 50只,5～8周齡,體重(25±5)g;成熟雄鼠 5只,10～16周齡,體重(30±5)g。由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

二、主要試劑與儀器

培養(yǎng)液 HTF和 HTF-HEPES為 InVitroCare公司產(chǎn)品;礦物油為 MediCult公司產(chǎn)品;血清替代品 SSS、磷酸鹽緩沖液(PBS)為Irvine公司產(chǎn)品;解脲支原體培養(yǎng)基購于珠海麗珠試劑公司;孕馬血清促性腺激素 (PMSG)和人絨毛膜促 性腺激素 (HCG)為寧波第二激素制品廠產(chǎn)品;高純度(99.999%)CO2氣體為杭州新世紀(jì)氣體有限公司生產(chǎn)。體視顯微鏡、倒置顯微鏡、相差顯微鏡均為日本 Nikon公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為英國 Galaxy公司產(chǎn)品;IVF工作站為丹麥 K-system系列產(chǎn)品。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.UU的菌數(shù)測定 采用顏色改變單位法(CCU),將菌液用培養(yǎng)基稀釋成 1×10-1～ 1×10-9系列濃度,經(jīng) 37℃恒溫培養(yǎng) 7d后,以培養(yǎng)基由黃色變?yōu)榧t色時的最高稀釋度作為顏色改變單位(CCU),菌液濃度以 CCU/ml計。

2.UU的培養(yǎng)方法 于取鼠卵前一天,取 -80℃凍存的UU標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng),顏色由黃色變?yōu)槁陨畹募t色時將培養(yǎng)基離心,棄上清,加入 100μl平衡的 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,輕輕吹打混勻。取 50μl作 CCU培養(yǎng),進(jìn)行菌數(shù)測定,其余置培養(yǎng)箱中備用。

3.小鼠超促排卵方法和成熟卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCS)的獲得 根據(jù) Hogan等[2]采用的方法進(jìn)行小鼠卵子的超排。于注射HCG后 16～18h用頸椎脫臼法處死雌鼠,切取雙側(cè)輸卵管,在培養(yǎng)液中劃破,COCS自動釋放后,將其移入HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,用細(xì)巴斯德管吹散,獲單個COCS。隨機(jī)分組后移入已平衡過夜的培養(yǎng)液中等待受精。

4.小鼠精子的采集及 IVF 選取健康的 8～10周齡的ICR雄鼠,處死后將附睪尾部及附帶的部分輸精管,置于 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液中,劃破雄鼠附睪尾部,精子自然游出,置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1h使其獲能。將獲能后的精子用 Makler精子計數(shù)板計數(shù),并用 HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液調(diào)整濃度至 1×106～5×106個/ml。按精卵比 10 000：1的比例將精子加入含有卵母細(xì)胞的培養(yǎng)液中進(jìn)行受精。

5.卵子分級標(biāo)準(zhǔn) Ⅰ級：卵細(xì)胞呈深色,放射冠完全沒有分散開,卵丘細(xì)胞緊密排列在一起,顏色偏深,卵丘細(xì)胞很小。常為不成熟或退化的卵子;Ⅱ級：卵細(xì)胞外觀顏色變淺,放射冠已呈不同程度的分散,卵丘細(xì)胞排列變疏松,顏色變淺。通常為已接近成熟的卵子;Ⅲ級：卵細(xì)胞外觀顏色很淡,形狀為規(guī)則的圓形,放射冠完全分散,卵丘細(xì)胞通常較大,排列疏松,顏色很淡。通常為成熟卵子;Ⅳ級：卵細(xì)胞顏色變深,放射冠分散,但外周卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失,通常為過熟卵子。選擇Ⅲ級卵子后續(xù)操作。

6.胚胎評分方法 對取卵后第 2天(D2組)或第 3天(D3組)胚胎分別按胚胎發(fā)育速度(細(xì)胞數(shù)目評分)、碎片程度和卵裂球?qū)ΨQ性進(jìn)行評估,計三者總分為一個胚胎的得分,具體評分方法見表 1。

表 1 胚胎質(zhì)量評分方法

7.不同生物群別 UU對小鼠IVF影響 實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的 3型或 8型 UU菌液,對照組不加 UU。按精卵比為10 000：1的比例將小鼠精子和COCS加入,培養(yǎng)過夜。第 2天,更換新鮮HTF(含 10%SSS)培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng) 72～75h,每天記錄胚胎生長情況。統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)組和對照組的體外受精率、D2胚胎評分及4-細(xì)胞期胚胎形成率。

受精率(%)=(≥2-細(xì)胞期胚胎數(shù))/(獲卵數(shù))×100%

4-細(xì)胞期胚胎形成率(%)=(≥4-細(xì)胞期胚胎數(shù))/(獲卵數(shù))×100%

四、統(tǒng)計學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)組與對照組 D2胚胎評分用(ˉx±s)表示,兩組間胚胎評分的比較用t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組與對照組間受精率、4-細(xì)胞期胚胎形成率的比較采用 χ2檢驗(yàn),采用 SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

結(jié) 果

一、各濃度 3型 UU對小鼠 IVF影響

3型UU在培養(yǎng)液中的終濃度分別為 104CCU/ml組(104組)、105CCU/ml組(105組)、106CCU/ml組 (106組)的 D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。105組和106組的受精率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

表 2 3型 UU各組 IVF情況比較

二、各濃度 8型 UU對小鼠 IVF影響

8型 UU在培養(yǎng)液中的終濃度為 102CCU/ml組(102組)的受精率、D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率等胚胎發(fā)育指標(biāo)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。UU終濃度分別為 104CCU/ml組(104組)、105CCU/ml組(105組)的受精率、D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。103CCU/ml組(103組)的受精率、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但其 D2評分與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05),見表2。

表 3 8型 UU各組 IVF情況比較

討 論

UU是引起泌尿生殖道炎癥的最常見的病原體,也是性傳播疾病(STD)的主要病原體。在男性精液中,UU感染約占10%～40%,而在女性生殖道炎癥中檢出率高達(dá) 64.39%～67.40%[3]。已有較多的證據(jù)表明UU感染與男性的非淋菌性尿道炎、男性不育、前列腺炎、附睪炎,女性的流產(chǎn)、早產(chǎn)、不孕不育、女性急慢性生殖道炎癥,新生兒低體質(zhì)量等均有較密切的關(guān)系。UU感染已引起臨床的高度關(guān)注,其致病性的相關(guān)因素值得探討。

有學(xué)者提出 14個血清型的致病力不盡相同[4],并非所有UU均具有致病性。有的血清型可以作為宿主正常攜帶的微生物,甚至在沒有性生活的幼女陰道內(nèi)也存在。史同新等[5]發(fā)現(xiàn)在 1～3歲健康幼兒泌尿生殖道中 UU的攜帶率為8.0%,以生物群 1為主,主要血清型是 1型和 6型。國內(nèi)王荷英等[6]對 172株 UU進(jìn)行血清學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：4型與非淋菌性尿道炎顯著相關(guān),3型在宿主因素和一定的環(huán)璄條件下,UU的寄居和致病狀態(tài)可相互轉(zhuǎn)化。Yoshida等[7,8]認(rèn)為,UU的T960生物型中2,5,8,9四種血清型與非淋菌性尿道炎有相關(guān)性,提出UU的 T960生物型可能是非淋菌性尿道炎的病原體,而Parvo生物型則可能在非淋菌性尿道炎的發(fā)生發(fā)展中沒有意義。朱慶義等[9]發(fā)現(xiàn)：性病門診患者臨床標(biāo)本中 UU陽性率 56.8%,其中 3型最多,占 16.7%,1型占 13%。而權(quán)力敏等[10]學(xué)者研究表明,血清型 3,4,10,11與感染有關(guān),血清型 6,14則以寄居形式在體內(nèi)呈攜帶狀態(tài)而不致病。因此,探討 UU不同血清型與致病性關(guān)系有重要的理論和實(shí)踐意義。人精液質(zhì)量與 UU感染的生物群也有關(guān),T960群感染可引起精子活動力明顯下降。2003年 Ren等[11]運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)進(jìn)行 UU基因分型,揭示正常攜帶狀態(tài)及感染狀態(tài)下 UU的基因型。認(rèn)為Parvo生物型,尤其是 1,3,6的單型別,在正常人群攜帶的可能性較大,而 T960生物型有可能和Parvo生物型中 1種以上血清型起協(xié)同作用或獨(dú)自導(dǎo)致疾病。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：3型UU濃度≤103CCU/ml、8型 UU濃度≤102CCU/ml時,受精率、D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率等胚胎發(fā)育指標(biāo)與對照組比較無差異(P＞0.05);3型UU濃度≥105CCU/ml、8型 UU濃度≥ 104CCU/ml時,受精率、D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率與對照組比較均有差異(P﹤0.01);而當(dāng) 3型 UU濃度為 104CCU/ml、8型 UU濃度為103CCU/ml時,受精率與對照組比較無差異,但 D2評分、4-細(xì)胞期胚胎形成率出現(xiàn)了差異,說明這一濃度為UU對小鼠的IVF造成抑制作用的臨界濃度,雖然受精率沒受到影響,但胚胎發(fā)育潛力受到抑制。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,隨著UU濃度的增高,對小鼠IVF及早期胚胎發(fā)育的影響也增大。UU的致病性與其血清型有關(guān),代表含有較大基因的生物群 2(或T960生物型)的血清型 8型UU可能較代表含有較小基因的Parvo生物型的血清型 3型UU具有更強(qiáng)的致病性。這與文獻(xiàn)報道 T960生物群可能是致病菌群,而 Parvo生物群可能是定植菌群有些相符[12,13],但 3型 UU并非不具有致病性,這可能與實(shí)際的臨床病例標(biāo)本中 Parvo生物型 UU未達(dá)到本實(shí)驗(yàn)研究中那么高的濃度有關(guān),也與觀察的方法和卵細(xì)胞的受精及其早期胚胎的發(fā)育對外界環(huán)境的敏感性高有關(guān)。低濃度的UU(3型 UU≤103CCU/ml、8型 UU≤102CCU/ml)對小鼠 IVF及早期胚胎發(fā)育未見影響,但其遠(yuǎn)期效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。

由于卵子質(zhì)量對 IVF的結(jié)果影響很大,因此在實(shí)驗(yàn)中必須選擇卵子分級標(biāo)準(zhǔn)為Ⅲ級的成熟卵子進(jìn)行隨機(jī)分組,在卵丘 -卵母細(xì)胞復(fù)合體自動釋放后嚴(yán)格去除卵細(xì)胞外觀顏色發(fā)黑的、形狀不規(guī)則的、卵丘細(xì)胞稀少的卵子。解脲支原體的培養(yǎng)基與胚胎培養(yǎng)基成分不同,對精子、卵子、胚胎均有一定的損害,因此一定要用高速離心法濃縮UU,并充分去除殘余的支原體培養(yǎng)基,再用經(jīng)平衡的胚胎培養(yǎng)基洗滌后再加入培養(yǎng)系統(tǒng),以排除支原體培養(yǎng)基對小鼠 IVF和早期胚胎發(fā)育的影響。

綜上所述,UU的致病性毒力與其生物群、濃度密切相關(guān),在臨床應(yīng)用上,分子檢測方法有望成為病原學(xué)診斷的常規(guī)方法[14]。但目前UU臨床檢測手段仍然有限,對UU致病性仍未最終定性,應(yīng)嚴(yán)格 UU感染的診斷,建立一個簡單、實(shí)用、可靠的UU分型的臨床檢測方法,避免過度治療和耐藥株的日益增多。

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3 劉小澄,林晨,黃環(huán)珍,等.解脲支原體與不孕、早孕、生殖道炎癥關(guān)系的探討.實(shí)用婦科學(xué)雜志,1997,13(6)：306～307.

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5 史同新,徐敬星,趙光.解脲脲原體在健康幼兒泌尿生殖道中的分子流行病學(xué)研究.中國艾滋病性病,2008,14(4)：389～391.

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8 Yoshida T,Deguchi T,Meda S,et al.Quantitative detection of Ureaplasma parvum(biovar 1)and Ureaplasma urealyticum(biovar 2)in urine specimens from men with and without urethritis by real-timepolymerase chain reaction.Sex Transm Dis,2007,34(6)：416～ 419.

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