王雪瑩 陸舍銘 朱 麗 孟昭宇 曹秋娥

（1.紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，玉溪 653100； 2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091）

超高效液相色譜法測(cè)定煙用香精中的歐前胡素

王雪瑩1，2陸舍銘1朱 麗1孟昭宇1曹秋娥2

（1.紅塔煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，玉溪 653100； 2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091）

建立了測(cè)定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜方法。以體積比為1∶1的乙腈-水溶液為萃取劑，采用ACQUITY UPLC?BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫為30℃，流動(dòng)相為乙腈-水，進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.2 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm，對(duì)20種煙用香精樣品進(jìn)行測(cè)定。歐前胡素的檢出限為0.039 5 μg／g，在0.16～8.00 mg／L范圍內(nèi)歐前胡素濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)。歐前胡素測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68%～2.97%(n=6)，回收率為90.83%～97.85%。

超高效液相色譜法 煙用香精 歐前胡素

歐前胡素是一種香豆素類(lèi)化合物，廣泛存在于中草藥及中成藥之中［1-6］，具有抗菌、平喘、抗過(guò)敏及解痙鎮(zhèn)痛等作用［7］。卷煙中添加煙用香精能夠改善卷煙吃味，提高卷煙品質(zhì)，目前越來(lái)越多的天然原料提取香精應(yīng)用于食品工業(yè)和化妝品等日用化工工業(yè)中。為了進(jìn)一步了解煙用香精有必要對(duì)其中的歐前胡素進(jìn)行檢測(cè)。

目前報(bào)道的歐前胡素的檢測(cè)方法主要為紫外分光光度法［8］、薄層掃描法［9，10］、高效液相色譜法［11-16］、液相色譜-質(zhì)譜法［17，18］、氣相色譜-質(zhì)譜法［19，20］等。超高效液相色譜法具有靈敏度高、精密度好、分析速度快、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此筆者建立了測(cè)定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜法。該法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速，能滿足煙用香精的實(shí)際檢驗(yàn)要求，適合批量煙用香精樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLCTM型，配備真空脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱箱、TUV檢測(cè)器和色譜工作站，美國(guó)Waters公司；

超純水儀：Millipore RiOs型，美國(guó)Millipore公司；

電子分析天平：PG503-S型，感量0.1 mg，瑞士Mettler公司；

超聲清洗儀：KQ700DB型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)TEDIA公司；

歐前胡素：標(biāo)準(zhǔn)品，99.6%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

冰乙酸：分析純，99.5%，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；

20種煙用香精樣品：紅塔煙草集團(tuán)；

0.22 μm水系濾膜、0.22 μm有機(jī)系濾膜：福建福州藍(lán)龍過(guò)濾器材有限公司；

歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：400.00 μg／mL，準(zhǔn)確稱取0.010 0 g（ 精確至0.000 1 g）歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，搖勻；

實(shí)驗(yàn)用水為二次石英蒸餾水，經(jīng)Millipore超純水儀處理，電阻率不小于18.2 MΩ·cm，使用前經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.50 g（精確至0.000 1 g）煙用香精樣品，置于50 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL體積比為1∶1的乙腈水溶液，于室溫下超聲萃取40 min。將萃取液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后移入2 mL樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析。

1.3 色譜分析條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水；梯度洗脫條件：0～5.0 min，10%～30%乙腈；5.0～25.0 min，30%～70%乙腈；25.0～28.0 min，70%乙腈；28.0～29.0 min，70%～10% 乙腈；29.0～30.0 min，10%乙腈；流速：0.2 mL／min；檢測(cè)器：TUV；檢測(cè)波長(zhǎng)：248 nm；柱溫：30℃；樣品室溫度：4℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 色譜圖

在1.2色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和煙用香精樣品進(jìn)行分析檢測(cè)，采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量，歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的UPLC色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

（1）流動(dòng)相的選擇和洗脫梯度的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中嘗試采用不同的流動(dòng)相進(jìn)行分離分析，其中包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、1%、2%）、乙腈-冰乙酸水溶液（其中冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、1%、2%）。試驗(yàn)結(jié)果表明采用甲醇-水體系作為流動(dòng)相時(shí)，色譜峰有拖尾，峰形不對(duì)稱；采用乙腈-水體系色譜峰尖銳，峰面積大，峰寬較窄。乙腈-乙酸水溶液與乙腈-水的洗脫效果相當(dāng)，故選擇乙腈-水作為本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

實(shí)驗(yàn)中比較了不同梯度洗脫程序，分析結(jié)果表明：采用梯度洗脫可以使被測(cè)組分得到完全分離，梯度不變改變洗脫的流速發(fā)現(xiàn)，流速越大，保留時(shí)間越短，峰面積越小，峰高越低；流速越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)，峰面積越大，色譜峰越寬。試驗(yàn)中優(yōu)化了淋洗液的流速，選擇1.3中的梯度洗脫條件，當(dāng)淋洗液的流速為0.20 mL／min時(shí)，歐前胡素的色譜峰尖銳且對(duì)稱。

（2）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于歐前胡素的結(jié)構(gòu)特征使其在252 nm和330 nm波長(zhǎng)附近都有紫外吸收。因此，為選擇適合歐前胡素的檢測(cè)波長(zhǎng)，分別在 242、246、248、250、254、256、258、260、320、324、326、330 nm 波 長(zhǎng) 下 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行掃描。分析結(jié)果顯示，在248 nm波長(zhǎng)下歐前胡素的峰形尖銳，有最大峰面積，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取一煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.000 1 g），分別采用10 mL的甲醇、乙腈，體積比為1∶1的甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-2%冰乙酸水溶液、乙腈-2%冰乙酸水溶液對(duì)該樣品進(jìn)行超聲萃取，將萃取液分別經(jīng)0.22 μm水系和有機(jī)系濾膜過(guò)濾后移入2 mL樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明：體積比為1∶1的乙腈水溶液萃取后樣品的色譜峰面積最大，色譜峰的峰型尖銳且分離完全，因此實(shí)驗(yàn)選取體積比為1∶1的乙腈-水溶液為萃取劑。

表1 不同萃取溶劑的分析結(jié)果

準(zhǔn)確稱取一煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.000 1 g），加入10 mL體積比為1∶1的乙腈水溶液，分別超聲萃取 10、20、30、40、50、60 min，將萃取液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾后移入2 mL樣品瓶，進(jìn)行超高效液相色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明：隨著萃取時(shí)間的不斷增加，色譜峰面積先增加后緩慢減小，超聲萃取40 min時(shí)色譜峰面積最大，因此選擇萃取時(shí)間為40 min。

表2 不同萃取時(shí)間的分析結(jié)果

2.3 線性方程

將歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋為0.16、0.80、1.60、4.00、8.00 μg／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按 1.3色譜條件對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積y為縱坐標(biāo)，歐前胡素濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

移取0.16 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL于進(jìn)樣瓶中，平行測(cè)定11次，以3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)值作為方法的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 歐前胡素的線性范圍、線性方程和檢出限

2.4 精密度及穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取1號(hào)、10號(hào)、11號(hào)煙用香精樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取6份，按1.2處理樣品，在1.3色譜分析條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，1 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，3種煙用香精樣品中歐前胡素測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.80%、0.68%、1.36%，說(shuō)明該分析方法具有較好的重現(xiàn)性；3 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣6次，歐前胡素測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.81%、1.84%、2.97%，說(shuō)明該方法處理樣品中的歐前胡素具有較好的穩(wěn)定性。

表4 歐前胡素分析方法的精密度及穩(wěn)定性

2.5 回收試驗(yàn)

在1號(hào)和10號(hào)煙用香精樣品中分別加入高、中、低3個(gè)不同量的標(biāo)準(zhǔn)樣品。準(zhǔn)確稱取添加標(biāo)樣后的1號(hào)和10號(hào)樣品0.50 g（精確至0.000 1 g），平行稱取3份，在1.3色譜分析條件下進(jìn)行分析，由本底值、加入量和測(cè)定值經(jīng)計(jì)算可得到歐前胡素的回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，歐前胡素的回收率在90.83%～97.85%之間。

表5 歐前胡素的回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取20種煙用香精樣品0.50 g（ 精確至0.0001 g）分別按1.2處理樣品，在1.3色譜分析條件下進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定兩份，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，被測(cè)的20種煙用香精樣品中大部分不含有歐前胡素，4種被測(cè)香精中含有歐前胡素，含量在 3.08～24.96 μg／g之間。

表6 20種煙用香精樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

建立了測(cè)定煙用香精中歐前胡素的超高效液相色譜法。對(duì)20種不同類(lèi)型的煙用香精進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明：被測(cè)定的20種煙用香精樣品中大部分不含有歐前胡素，4種被測(cè)香精中含有歐前胡素，含量在3.08～24.96 μg／g之間。該方法簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好。

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DETERMINATION OF IMPERATORIN IN TOBACCO FLAVOR BY RP-UPLC

Wang Xueying1，2，Lu Sheming1，Zhu Li1，Meng Zhaoyu1，Cao Qiue2
［1.R&D Center of Hongta Tobacco(Group) Co. Ltd.，Yuxi 653100，China；2.College of Chemical Science and Engineering，Yunnan University，Kunming 650091，China］

A method for determination of imperatorin in tobacco flavor by reversed phase ultra performance liquid chromatography was established. 20 kinds of tobacco flavor samples were extracted by acetonitrile-water (volume ratio of 1∶1),separated at 30℃ on ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm) column and eluted with acetonitrile-water as the mobile phase. Flow rate was 0.2 mL／min and the detection wavelength was 248 nm.The detection limit of imperatorin was 0.039 5 μg／g. The content of imperatorin was linear with the peak area in the range of 0.16-8.00 mg／L(r=0.999 9). The RSD of imperatorin determination results was 0.68%-2.97%, and the average recoveries of imperatorin ranged from 90.83 % to 97.85 %.

UPLC， tobacco flavor， imperatorin

陸舍銘，lushe@ustc.edu

2011-08-26