宋熙熙 陳樹(shù)大 劉 濤

(嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001)

頭孢拉定與血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究

宋熙熙 陳樹(shù)大 劉 濤

(嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001)

采用熒光和紫外吸收光譜法研究頭孢拉定和牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，頭孢拉定熒光猝滅牛血清白蛋白是由于形成了頭孢拉定-牛血清白蛋白復(fù)合物。分別計(jì)算了不同溫度下雙分子猝滅常數(shù)kq和結(jié)合常數(shù)K。由熱力學(xué)參數(shù)焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG)，推斷出頭孢拉定與BSA的相互作用是一個(gè)疏水作用的自發(fā)過(guò)程。

頭孢拉定 牛血清白蛋白 熒光猝滅 熱力學(xué)參數(shù)

頭孢拉定(分子式C16H19N3O4S)是一種穩(wěn)定性好、刺激性小，在臨床上廣泛使用的唯一可供口服和注射的頭孢菌素。頭孢拉定毒性低，治療指數(shù)大，不良反應(yīng)少，對(duì)腎毒性低，因此在治療和預(yù)防多種感染中具有較好的療效。

血清白蛋白是血漿中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子等重要生理功能，對(duì)藥物在體內(nèi)的代謝和分布產(chǎn)生很大影響。筆者選用牛血清白蛋白為蛋白模型，從不同角度考察血清白蛋白與頭孢拉定的相互作用，對(duì)闡明頭孢拉定在體內(nèi)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程、血清白蛋白的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系以及生物大分子與藥物小分子的相互作用的化學(xué)本質(zhì)具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

分子熒光分光光度計(jì)：Gary Eclipse型，美國(guó)Varian公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-2550型，日本島津公司；

頭孢拉定：浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠生產(chǎn)，以pH 7.4 Tris-HCl緩沖液配制成濃度為1.5×10-3mol／L的儲(chǔ)備液；

牛血清白蛋白V(BSA)：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，用緩沖液配制成濃度為2.0×10-5mol／L的儲(chǔ)備液，保存于4℃的冰箱中，備用；

NaCl溶液：0.1 mol／L，用以維持溶液離子強(qiáng)度，寧波市化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在不同溫度(25、30、37℃)下，采用分子熒光光譜法測(cè)定牛血清白蛋白溶液及與不同濃度的頭孢拉定溶液混合后的熒光光譜，分析熒光強(qiáng)度變化的原因。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光分析

對(duì)BSA預(yù)掃描，得到BSA最大激發(fā)波長(zhǎng)為228 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為339 nm。因此以228 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄BSA的熒光光譜及頭孢拉定對(duì)BSA的熒光猝滅；以228 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄BSA和含不同濃度頭孢拉定時(shí)BSA的發(fā)射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度頭孢拉定的BSA熒光猝滅光譜

2.2 猝滅常數(shù)kq

分子間的作用不同可以導(dǎo)致不同的猝滅方式，典型的猝滅方式有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅［1］。為了確定此猝滅過(guò)程的機(jī)制，先假設(shè)頭孢拉定對(duì)BSA的熒光猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程，應(yīng)服從Stern-Volmer方程：

式中：F0——猝滅體不存在時(shí)的熒光強(qiáng)度；

F——加入猝滅體后的熒光強(qiáng)度；

kq——雙分子猝滅常數(shù)，L／(mol·s)；

τ0——猝滅體不存在時(shí)熒光體的熒光壽命，ns；

c(Q)——猝滅體濃度，mol/L；

kd——Stern-Volmer常數(shù)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得τ0的值在1～10 ns之間［2］，為了計(jì)算方便，一些文獻(xiàn)取τ0為1 ns［3，4］，另有文獻(xiàn)取τ0=l0 ns［5，6］。本實(shí)驗(yàn)取τ0=1 ns。以F0／F-1對(duì)c(Q)作圖，得到不同溫度下的kq值，見(jiàn)表1。

表1 不同溫度下BSA與頭孢拉定的雙分子猝滅常數(shù)kq(pH 7.4)

由表1可以看出，頭孢拉定與BSA相互作用，在228 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，不同溫度時(shí)的雙分子猝滅常數(shù)kq遠(yuǎn)大于各種猝滅體對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L/ (mol ·s)［7］，說(shuō)明此猝滅過(guò)程不是由于動(dòng)態(tài)猝滅引起的。隨著頭孢拉定濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度有不同程度的猝滅，且BSA的熒光峰位沒(méi)有發(fā)生改變，所以初步確定加入藥物后，BSA的結(jié)構(gòu)基本上沒(méi)有發(fā)生變化。由此推測(cè)，此猝滅過(guò)程可能是由于頭孢拉定與BSA形成了締合物而引起的靜態(tài)猝滅，也就是說(shuō)此猝滅過(guò)程是由于藥物與BSA在基態(tài)時(shí)生成了復(fù)合物，從而導(dǎo)致BSA的熒光強(qiáng)度猝滅。

2.3 結(jié)合常數(shù)K和活化能Ea

頭孢拉定和BSA的結(jié)合常數(shù)較大，形成結(jié)合位點(diǎn)，且受溫度影響較大，說(shuō)明頭孢拉定與BSA有較強(qiáng)的結(jié)合作用，可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

根據(jù)方程［8］：

表2 不同溫度下BSA與頭孢拉定的結(jié)合常數(shù)K(pH 7.4)

根據(jù)阿倫尼烏斯方程lnK=lnA-Ea／RT，可得結(jié)合活化能Ea為935.2 kJ／mol ，表示活化分子的平均能量與反應(yīng)物分子平均能量的差值。溫度升高，體系中分子間的碰撞的幾率增加，BSA與頭孢拉定分子的有效碰撞加劇，活化分子增多?；罨芘c反應(yīng)速率的大小有著密切的關(guān)系，活化能越小反應(yīng)速率越大。

2.4 結(jié)合距離

根據(jù)Forster理論［9,10］，無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移效率E可表示為：

其中R0為轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離，計(jì)算公式為：

根據(jù)文獻(xiàn)［11］，其中K2=2/3，為空間取向因子，φD為供體的熒光量子產(chǎn)率，φD=0.118，n是介質(zhì)的折射指數(shù)，n=1.336，J為供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分：

其中FD(λ)為熒光供體在波長(zhǎng)為λ時(shí)的熒光強(qiáng)度，ε(λ)為受體在波長(zhǎng)為λ時(shí)的摩爾消光系數(shù)。能量轉(zhuǎn)移效率E還可以表示為：

式中：F——藥物與BSA的濃度比為1∶1時(shí)的熒光強(qiáng)度；

F0——未加入藥物時(shí)的熒光強(qiáng)度。

根據(jù)式(3)～式(6)可以求得在228 nm波長(zhǎng)激發(fā)下，不同的J，E和r值。以25℃為例：

2.5 熒光猝滅過(guò)程中熱力學(xué)函數(shù)的變化與作用力判斷

藥物等有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有疏水作用力、氫鍵作用力、范德華力和靜電引力等。Ross等［12］根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)規(guī)律總結(jié)，利用反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對(duì)大小來(lái)判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類(lèi)型：ΔH＞0，ΔS＞0時(shí)為疏水作用力；ΔH＜0，ΔS＜0時(shí)為氫鍵和范德華力；ΔH＜0，ΔS＞0時(shí)為靜電引力。在溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的ΔH可以看作一個(gè)常數(shù)。由下列公式可得ΔG、ΔH和ΔS。

應(yīng)指出BSA結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，藥物與它之間往往同時(shí)存在幾種作用力。根據(jù)以上公式求得熒光猝滅實(shí)驗(yàn)中頭孢拉定與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)函數(shù)值見(jiàn)表3。可知熒光猝滅實(shí)驗(yàn)推測(cè)出頭孢拉定藥物與BSA之間的主要作用力均為疏水作用力［13,14］。

表3 BSA與頭孢拉定相互作用的熱力學(xué)常數(shù)及作用力

3 結(jié)論

采用分子熒光光譜法研究了生物大分子牛血清白蛋白BSA與藥物小分子頭孢拉定的相互作用，研究結(jié)果表明，BSA的熒光峰位置相同，均為343 nm左右，說(shuō)明了結(jié)合過(guò)程中BSA的結(jié)構(gòu)基本保持不變，并且隨頭孢拉定濃度的增加，熒光強(qiáng)度不斷減弱，BSA與頭孢拉定分子結(jié)合，生成了相應(yīng)的復(fù)合物，導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光猝滅。由Stern-Volmer方程可到結(jié)合作用的雙分子猝滅常數(shù)，該猝滅常數(shù)遠(yuǎn)小于生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)，說(shuō)明該結(jié)合過(guò)程是一個(gè)靜態(tài)猝滅過(guò)程，由Linewerver-Burk雙倒數(shù)模型，得到不同溫度下BSA與頭孢拉定相互結(jié)合的結(jié)合常數(shù)K，討論了相關(guān)的熱力學(xué)常數(shù)，可知該結(jié)合作用是在自發(fā)的作用下進(jìn)行，通過(guò)一定的非價(jià)鍵力，即分子間疏水作用進(jìn)行，結(jié)合反應(yīng)速率較快。

［1］楊頻，高飛.生物無(wú)機(jī)化學(xué)原理［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：331-335.

［2］Lakowicz J R，Weber G.Quenching of fluorescence by oxygen：a probe for structural fluctuations in macromolecules［J］.Biochemistry，1973，12(21)： 4 161-4 165.

［3］楊斌盛，楊頻.人血清白蛋白與金屬離子作用的熒光光譜研究［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1992，19(2)：110-114.

［4］朱鏗，童沈陽(yáng).熒光黃與蛋白質(zhì)相互作用的研究［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1996，17(4)： 539-542.

［5］上官云鳳，顏承農(nóng)，馮志云，等.二苯基(2-氯苯基)甲醇與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)特征研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2004，23(6)：32-35.

［6］姚武，高峰，王倫.依諾沙星與牛血清白蛋白相互作用的熒光法研究［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2005，24(1)： 76-82.

［7］Elo Ware W R. Oxygen quenching of fluorescence in solution： an experimental study of the diffusion process［J］.J Phys Chem，1962，66： 455-463.

［8］馬貴斌，楊頻.熒光法研究血清自蛋白與藥物的結(jié)合作用［J］.生物化學(xué)雜志，1992，8(5)： 624-628.

［9］楊曼曼，楊頻，張立偉.熒光法研究咖啡酸類(lèi)藥物與自蛋白的作用［J］.科學(xué)通報(bào)，1994，39(1)： 31-38.

［10］Forster T. Modern Quantum Chemistry (Vol.3) ［M］. New York：Academic Press, 1996： 93-106.

［11］Lakowicz J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy ［M］.3rd Ed. New York： Springer, 2006： 445-457.

［12］Ross P D, Subramanian S. Thermodynamics of protein association reactions： forces contributing to stability ［J］. Biochemical, 1981, 20(11)： 96-102.

［13］熊和玉，汪敬武.頭孢菌素類(lèi)抗生素分析方法研究進(jìn)展［J］.江西化工，2003(3)： 16-22.

［14］劉洛生，趙麗，葛蔚穎.頭孢克羅與人血清白蛋白相互作用機(jī)制［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2003，23(4)： 769-774.

SPECTROSCOPIC STUDIES OF INTERACTION BETWEEN CEPHRADINE AND BOVINE SERUM ALBUMIN

Song Xixi, Chen Shuda, Liu Tao
(College of Biological, Chemical Sciences and Engineering, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China)

The interaction between cephradine and bovine serum albumin (BSA)was investigated by fluorescence and UV absorption spectroscopy. In the mechanism discussion，it was proved that the fluorescence quenching of BSA by cephradine resulted from the formation of cephradine-BSA complex. The quenching constantkqand the binding constantKat different temperatures were calculated. The thermodynamic parameters，enthalpy change(ΔH), entropy change(ΔS) and Gibbs free energy change (ΔG) were calculated respectively，which indicated that the interaction of cephradine with BSA was a spontaneous process mainly by hydrophobic interaction.

cephradine, bovine serum albumin, fluorescence quenching, thermodynamic parameter

2011-05-08