虞 杰，石偉強(qiáng)

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123）

全自動(dòng)免疫組化儀的應(yīng)用及影響其染色質(zhì)量的因素探討

虞 杰1,2，石偉強(qiáng)1

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123）

目前，在免疫組織化學(xué)染色中，全自動(dòng)免疫組化儀越來越多地得到應(yīng)用。與傳統(tǒng)手工操作方法相比，它具有精確、科學(xué)、靈活、方便、高效、環(huán)保的特點(diǎn)，優(yōu)勢明顯。同時(shí)，新設(shè)備的使用也帶來了很多新的問題，對染色結(jié)果存在很多新的影響因素。對全自動(dòng)免疫組化儀的這些優(yōu)勢和不足進(jìn)行探討，有利于更好地保證染色質(zhì)量，從而進(jìn)一步保證診斷的準(zhǔn)確性。

全自動(dòng)免疫組化儀；染色質(zhì)量；應(yīng)用；影響因素

免疫組織化學(xué)染色一直是病理診斷的重要輔助手段，近年來，隨著免疫組織化學(xué)新抗體的不斷出現(xiàn)，免疫組織化學(xué)也正逐漸走出單一的輔助常規(guī)病理診斷的角色，發(fā)展為科學(xué)研究、判斷病人愈后以及協(xié)助臨床用藥的重要輔助手段。新的定位與責(zé)任對免疫組化結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性要求也隨之提高，因此，制片質(zhì)量的高低顯得更為重要。近年來，各種型號自動(dòng)免疫組化儀投入應(yīng)用，這一更精確、更科學(xué)、更靈活、更方便、更高效、更環(huán)保的免疫組化染色方式正在被越來越多的醫(yī)療機(jī)構(gòu)、科研院所所接受。新設(shè)備的運(yùn)用使得以往手工操作方式下免疫組織化學(xué)染色的很多影響因素得到解決。但是，它的使用同時(shí)也帶來了一些新的問題，有待得到有效解決。本科室自2010年起使用美國羅氏公司BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化儀，對其優(yōu)勢及影響其染色結(jié)果的具體因素進(jìn)行了一些歸納和總結(jié)。

1 材料與方法

1.1材料儀器與試劑 選取我院2010年1月到2011年6月淋巴瘤組織標(biāo)本30例及乳腺癌組織標(biāo)本各20例，美國羅氏公司BenchMark XT全自動(dòng)多功能組織病理檢測系統(tǒng)主機(jī)（包含檢測試劑模塊、染色模塊、散裝液體模塊及廢液收集模塊），此外還有與之配套的惠普計(jì)算機(jī)及專業(yè)操作軟件（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）、激光條碼標(biāo)簽打印機(jī)(VENTANA)。試劑選用DAKO公司的濃縮型一抗以及儀器系統(tǒng)配套的250次檢測試劑盒（主要包括二抗、DAB顯色系統(tǒng)、蘇木素返藍(lán)復(fù)染系統(tǒng)等）、脫蠟液、液體封蓋膜、氯化鈉檸檬酸鈉、reaction buffer、CC1細(xì)胞預(yù)處理液、CC2細(xì)胞預(yù)處理液等。

1.2 方法 選用15種淋巴瘤及乳腺癌常用抗體分別進(jìn)行手工及全自動(dòng)免疫組化儀染色，10%中性福爾馬林固定，一般以4-6h為宜，最長不超過24h，常規(guī)包埋組織石蠟塊，常規(guī)切片（4-6um）并將切片撈于預(yù)先經(jīng)過2%APES丙酮處理過的防脫玻片上，60℃烘箱烘干1-2h以上。

手工染色方法采用Elivison兩步法進(jìn)行染色。

自動(dòng)染色方法使用專業(yè)電腦操作程序（VENTANA Medical System-BenchMark XT IHC/ISH Stainingmodule）將日常使用的指標(biāo)一一進(jìn)行染色流程的編輯設(shè)置（主要是各種染色試劑信息：是否由機(jī)器脫蠟、復(fù)染；是否自動(dòng)滴加一抗、脫蠟、抗原修復(fù)；設(shè)定一抗、二抗、復(fù)染的時(shí)間和溫度等）并保存。

配制各種常用一抗，充填于與主器配套的專門試劑瓶，編輯掃描試劑瓶上的激光條碼，使之與之前所保存的相應(yīng)指標(biāo)的染色流程相聯(lián)。

掃描系統(tǒng)配套的250次檢測試劑盒（主要包括二抗、DAB顯色系統(tǒng)、蘇木素返藍(lán)復(fù)染系統(tǒng)等），并將其安裝于可拆分試劑架上。

將儀器廠家配套的主機(jī)散裝液體模塊中的各種試劑（包括脫蠟液、液體封蓋膜、氯化鈉檸檬酸鈉、reaction buffer、CC1細(xì)胞預(yù)處理液、CC2細(xì)胞預(yù)處理液等）按說明書要求比例進(jìn)行調(diào)配，并充填于主機(jī)相對位置的試劑瓶中。所有的試劑使用前都要通過激光條碼掃描系統(tǒng)預(yù)先確認(rèn)。

編輯打印防水條碼切片標(biāo)簽（包括免疫指標(biāo)、病理號、免疫號、送檢醫(yī)院等病人信息），粘貼于切片一側(cè)。將切片分別置于染色模塊中的獨(dú)立溫控切片位上。再將裝有一抗及儀器配套檢測試劑盒的試劑架安裝于主機(jī)旋轉(zhuǎn)式試劑臺上。點(diǎn)擊電腦操作軟件中的“RUN”鍵設(shè)定本次染色切片數(shù)（1-30張），并根據(jù)需要選擇是否設(shè)定延遲染色開始或結(jié)束時(shí)間，點(diǎn)擊確定開始程序，此后所有染色工作均由機(jī)器自動(dòng)完成。

自動(dòng)染色程序完成后，取出切片插入切片架，用洗潔精清洗切片上的殘余油膜和試劑，清水沖洗，之后梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

2 結(jié)果及優(yōu)勢

2.1 本系統(tǒng)對每種抗體都專門設(shè)定了獨(dú)立詳細(xì)的染色流程，抗體滴加完全由系統(tǒng)通過激光掃描條碼確認(rèn)執(zhí)行，每一張切片每一步的反應(yīng)條件都可以得到精確控制。與手工染色結(jié)果比較分別見表1和圖1-圖4。

由表1和圖1-4可見，全自動(dòng)免疫組化儀染色有效避免了人工操作條件下的錯(cuò)誤，染色結(jié)果的均一性和可重復(fù)性得到了保證，染色結(jié)果強(qiáng)度較高，著色均勻，定位準(zhǔn)確，背景清晰，無邊緣效應(yīng)，整體上比較令人滿意。

2.2 通過對染色開始時(shí)間及結(jié)束時(shí)間的合理設(shè)置，可以較為有效地解決該系統(tǒng)每批次處理切片數(shù)量較少的不足，從而提高工作效率。

2.3 全自動(dòng)的染色過程，大幅度節(jié)約了人力，使實(shí)驗(yàn)操作人員得以科學(xué)安排工作，提高了工作效率。

2.4 由于使用的試劑中不含有二甲苯以及系統(tǒng)對廢液中毒性較強(qiáng)的DAB的合理處理，大大減少了有毒物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)操作者身體的危害，增加了環(huán)保性和安全性，提升了實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境質(zhì)量[1]。

3 染色結(jié)果的影響因素

3.1 組織的前期處理 固定時(shí)間要嚴(yán)格控制，一般以4-6h為宜，最長不超過24h，過長過短都會(huì)對染色結(jié)果產(chǎn)生不良影響。研究表明，組織固定時(shí)間不足易造成組織結(jié)構(gòu)不清和抗原彌散，固定時(shí)間過長則會(huì)破壞或封閉組織的抗原活性，影響染色結(jié)果[2]。

3.2 切片的質(zhì)量 良好的切片質(zhì)量是保證染色質(zhì)量的基本要求，切片要盡量做到平整，厚度適宜(4-6um)，盡量避免刀痕皺褶，有研究表明，刀痕和皺褶部位易引起假陽性[3]。應(yīng)在切片前對組織蠟塊進(jìn)行-20°C左右低溫冰凍3-5min，擰緊切片機(jī)各部位固定螺栓，切片時(shí)盡量避開刀鋒缺口部位及使用新刀片，可有效避免刀痕和皺褶。

3.3 涂膠片的制備 脫片會(huì)直接影響染色結(jié)果。因此前期對玻片的處理是做好免疫組化的重要前提之一，最好使用涂膠玻片，防脫片效果較好。目前免疫組織化學(xué)染色中兩種防脫片劑多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine）和APES較為常用。多聚賴氨酸防脫片原理主要是通過多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。而APES則通過化學(xué)修飾玻璃表面，改變其物理化學(xué)特性從而達(dá)到防脫片效果。經(jīng)過實(shí)踐研究表明，經(jīng)過APES處理的玻片防脫片效果較好[4]。應(yīng)使用2%APES丙酮預(yù)先浸泡玻片1-2min，丙酮浸泡1-2min，再用蒸餾水浸洗1-2min，烤干備用，這樣可以有效防止脫片。

3.4 試劑 抗體的質(zhì)量是染色成功與否的重要保證，要選擇品牌好、質(zhì)量過關(guān)的試劑，多次實(shí)驗(yàn)表明，基因、邁新、中山等公司的產(chǎn)品使用效果都較為理想。

各種試劑均應(yīng)嚴(yán)格按照廠商要求的濃度比例進(jìn)行配制，且使用前必須徹底混勻，否則易造成假陰性甚至完全不著色的結(jié)果。

多數(shù)試劑的最佳保存溫度為4℃左右。溫度過高會(huì)引起試劑效價(jià)降低。手工方法進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，各種抗體試劑只需依次在使用時(shí)臨時(shí)從4℃冰箱取出滴加，滴加完畢后立即放回冰箱，在外部環(huán)境中放置時(shí)間較短。使用全自動(dòng)免疫組化儀染色時(shí)，由于旋轉(zhuǎn)式試劑臺是開放式的，不具備溫度調(diào)節(jié)功能，整個(gè)染色過程的3-4h中，所有試劑都長時(shí)間暴露在外部環(huán)境中，因此對實(shí)驗(yàn)室的溫度有較高要求。正常情況下實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)最好控制在25℃以下，且對于暫時(shí)不用的試劑也應(yīng)及時(shí)放入4℃冰箱保存。

3.5 試劑瓶安裝及檢查 雖然本機(jī)通過激光條碼掃描識別試劑瓶，對試劑瓶的安裝順序沒有嚴(yán)格的要求，但有時(shí)機(jī)器自檢時(shí)并不一定能夠發(fā)現(xiàn)試劑瓶安裝位置上的一些細(xì)小偏差，會(huì)導(dǎo)致程序運(yùn)行時(shí)試劑不能順利通過試劑盤底部的滴加孔滴加到標(biāo)本上，造成假陰性，因此，在正式運(yùn)行程序前，必須仔細(xì)檢查各個(gè)試劑是否安裝到位、準(zhǔn)確無誤，確認(rèn)試劑瓶滴加口是否對準(zhǔn)底盤滴加孔。

有些特殊情況下試劑瓶發(fā)生泄露，會(huì)導(dǎo)致瓶中試劑余量低于系統(tǒng)默認(rèn)余量；試劑瓶滴加口空氣未能排空，可導(dǎo)致染色程序運(yùn)行過程中部分試劑無法成功滴到部分或全部切片上，造成染色失敗。因此正式運(yùn)行程序前必須檢查各試劑瓶中液面高度以及滴加口是否有空氣未被排空。

3.6 其他因素 除以上諸種因素外，還有其他一些因素也應(yīng)引起注意，如應(yīng)為系統(tǒng)配置專用不間斷電源，以防止系統(tǒng)運(yùn)行期間突然斷電造成的損害；由專人定期做好機(jī)器的清洗及日常維護(hù)保養(yǎng)工作，使之保持最佳狀態(tài)；盡量不要在機(jī)器配套的電腦上插外來盤或安裝無關(guān)軟件，防止計(jì)算機(jī)病毒侵害或加重系統(tǒng)負(fù)擔(dān)。

其他一些品牌型號的自動(dòng)免疫組化儀如美國BioGenex i6000全自動(dòng)免疫組化染色儀，不具備組織切片脫蠟、抗原修復(fù)以及染色后的蘇木素復(fù)染、分化、返藍(lán)功能，也不具備激光條碼標(biāo)簽掃描功能，每次染色前都需要操作人員通過系統(tǒng)對組織切片及試劑安裝位置進(jìn)行一一設(shè)置。同時(shí)，由于無法調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度以及無法預(yù)先針對各種不同抗體設(shè)置獨(dú)立染色程序，因此對染色條件也達(dá)不到精確控制，切片染色很難達(dá)到最佳效果。而沒有經(jīng)過環(huán)保處理過的廢液也會(huì)對環(huán)境及操作人員的身體造成危害。相比之下，BenchMark XT全自動(dòng)免疫組化儀很好地解決了上述問題。當(dāng)然，即使是再先進(jìn)的全自動(dòng)免疫組化儀也不是完美無缺的，實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員豐富的工作經(jīng)驗(yàn)以及認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度同樣是切片染色質(zhì)量的重要保證。

[1]羅小平,胡維維,伍尚金.全自動(dòng)免疫組化染色儀與人工操作的比較[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2007,28(4):59-60.

[2]梁英杰.免疫組織化學(xué)技術(shù)制片的規(guī)范和質(zhì)量控制[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2004,13(2):262-264.

[3]陳萍倩,張蓉,陸敏華,等.自動(dòng)免疫組化染色儀在免疫組化染色中的應(yīng)用[J].JDiag Pathol,2003,10(4):238.

[4]虞杰,顧冬梅,郭凌川.肪脫片劑在免疫組織化學(xué)染色中的應(yīng)用[J].中國血液流變學(xué)雜志,2008,18(3):432-433.

[5]楊月紅,袁靜萍,袁修學(xué),等.自動(dòng)免疫組化儀的使用體會(huì)[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理雜志,2011,27(3):333-334.

[6]姜冰,楊軍,彭長纓,等.全自動(dòng)免疫組化染色儀在臨床病理的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(18):2745-2746.

[7]孫琪,李燕,李晶.免疫組化染色質(zhì)量控制的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(1):146-147.

Investigation for Application and Factorsof Influencing Staining Qualitiesof Immunohistochem istry Autostainer

YU Jie,SHIWei-qiang
(Department of Pathology,ThefirstAffiliatedHospital of SuzhouUniversity,SuzhouJiangsu215006,China)

In current,immunohisto chemistry auto stainerha sbeen applicated in immunohi stoche mistry staining moreand more.Comparew ith traditiona lmanual operation.It has some good ness like accurat escientific flexible convenient efficient environmental.

immunohis to chemistry autostainer;staining qualities；application;influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0069-03

虞杰（1979-）,男,江蘇蘇州人,主管技師,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)椴±砼c病理生理學(xué).

（責(zé)任編輯 劉 紅）