鐘振聲 樊麗妃 黃繼兵

(華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，廣東廣州510640)

互葉白千層茶樹原生長于澳大利亞新南威爾士州的北部沿海，其茶樹油與世界各地的相比產(chǎn)量最大、質(zhì)量最佳，目前世界各地多有引種，我國廣西、廣東、海南等地也有大規(guī)模的栽培，其中廣西為主要產(chǎn)區(qū)［1］.文獻(xiàn)報道［2］茶樹精油具有廣譜抗微生物、抑菌、環(huán)保、溫和天然清香、無污染無腐蝕、滲透性和生物降解力強的性質(zhì).茶樹油應(yīng)用于個人護(hù)理品(頭發(fā)護(hù)理、身體護(hù)理、洗腳液、肥皂、抗菌型洗手液、口氣清新劑及口腔護(hù)理用品)、健康用品(急救乳液、殺菌劑、燒傷護(hù)理等)中，可起到消炎抑菌、止痛、止癢的作用，現(xiàn)已進(jìn)入美國食品、藥品監(jiān)督局采購名單.國際上茶樹油已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化工等領(lǐng)域，而在中國，茶樹油的應(yīng)用市場還不成熟.我國對茶樹油的認(rèn)識時間較短，目前僅在日化行業(yè)有所使用.茶樹油的應(yīng)用作為一個新興產(chǎn)業(yè)，具有良好的開發(fā)價值和發(fā)展?jié)摿?加強茶樹油的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，提高我國茶樹油的質(zhì)量，開發(fā)茶樹油的新產(chǎn)品，具有十分重要的意義.

國內(nèi)外文獻(xiàn)采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)對茶樹油的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要成分有4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯、1，8-桉葉素等，其主要抑菌活性成分是4-松油醇.居解語等［3］對不同茶樹油樣品進(jìn)行了成分差異研究，發(fā)現(xiàn)主要是1，8-桉葉素、γ-松油烯、異松油烯和4-松油醇這幾種成分含量有較大差異.文中對從澳大利亞引進(jìn)、經(jīng)過十年選種培育的廣西玉林互葉白千層茶樹油進(jìn)行了化學(xué)成分分析及抑菌活性研究，以此來揭示互葉白千層茶樹油異地引種后的化學(xué)成分及抑菌活性的變化.

1 實驗部分

1.1 主要材料與儀器

茶樹油，廣西玉林市玉州區(qū)互葉白千層(澳洲茶樹)種植基地提供，茶樹引種已十年.大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，取自廣州工業(yè)微生物檢測中心菌種庫.無水乙醇、95%乙醇、蔗糖、氯化鈉、氫氧化鈉，均為分析純;瓊脂、牛肉浸膏、蛋白胨，均為生化試劑.

QP2010型氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本SHIMADZU公司;SPX-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;XS-212型生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司;SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YX-280D型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;10mm×7.8mm×(6±0.1)mm型牛津杯，浙江省寧海健民醫(yī)療儀器廠.

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樹油理化常數(shù)的測定

相對密度依據(jù)GB/T 11540—2008測定;折光指數(shù)依據(jù)GB/T 14454.4—2008測定;旋光度依據(jù)GB/T 14454.5—2008測定;閃點依據(jù)GB/T 14454.6—2008測定;乙醇中溶解(混)度依據(jù)GB/T 14455.3—2008測定.

1.2.2 茶樹油的化學(xué)成分分析方法

稱取一定量茶樹油，用正己烷配制成質(zhì)量濃度約為5mg/mL的樣品溶液.采用GC/MS對茶樹油進(jìn)行定性和定量分析［4］.

氣相色譜:色譜柱為DB-5MS(30m×0.25mm×0.25mm);樣口溫度為260℃;載氣為高純氦;柱流量為1.0mL/min;分流比為100∶1;進(jìn)樣量為1μL;程序升溫起始溫度為70℃，速率為2℃/min，終止溫度為180℃.質(zhì)譜:電離方式為EI;電子能量為70eV;接口溫度為250℃;離子源溫度為200℃;溶劑延遲2 min;加速電壓為1.00 kV;掃描范圍為45～500 u.

1.2.3 抑菌活性和最小抑菌濃度的測定

采用二倍稀釋法，用5%(體積分?jǐn)?shù))的無菌吐溫-80溶液將茶樹油配成體積分?jǐn)?shù)分別為20%、5%的茶樹油溶液［5］.采用牛津杯法［6］測茶樹油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，以相同體積分?jǐn)?shù)的溶劑做對比實驗.

用混合藥劑法［7］測茶樹油對大腸桿菌和金黃色葡萄球的最小抑菌濃度(MIC).在培養(yǎng)基凝固前加入一定量的茶樹油，混合均勻，使培養(yǎng)基中含一定量的茶樹油.待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基表面劃線接種細(xì)菌，37℃培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長情況.每一種添加量做3個平行實驗，以5%的無菌吐溫-80溶液作為對照組.完全無菌生長的茶樹油的添加量即為最小抑菌濃度(MIC).

1.2.4 茶樹油抑菌活性的穩(wěn)定性分析

根據(jù)文獻(xiàn)［8］，在固體培養(yǎng)基凝固前將pH值分別調(diào)到 4、5、6、7、8、9、10、11，然后用比各菌的 MIC低一個體積分?jǐn)?shù)梯度的茶樹油溶液進(jìn)行抑菌實驗，比較不同pH值下該茶樹油溶液的抑菌活性，確定其pH值活性范圍(方法同MIC測定).實驗中以相應(yīng)添加量的吐溫-80水溶液作對照.

在固體培養(yǎng)基凝固前加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖、食鹽進(jìn)行抑菌實驗(與pH值影響實驗條件相同)，研究蔗糖、食鹽對互葉白千層茶樹油抑菌活性的影響.以吐溫-80水溶液作對照.

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹油的理化常數(shù)

采用國標(biāo)方法測得的茶樹油的相對密度、折光指數(shù)、旋光度、閃點及在乙醇中的溶解度如表1所示.

將測得的理化常數(shù)與ISO國際標(biāo)準(zhǔn)［8］相比較，發(fā)現(xiàn)引種茶樹油除了在乙醇中的溶解度符合該標(biāo)準(zhǔn)之外，其余幾項常數(shù)均不在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍之內(nèi).這是由于該標(biāo)準(zhǔn)是對4-松油醇型茶樹油的規(guī)定，而受測茶樹油的成分與常規(guī)的澳洲茶樹油相比，已經(jīng)有了較大的改變，從而使得其理化常數(shù)與國際標(biāo)準(zhǔn)不同，具體見下文的分析.

2.2 茶樹油的化學(xué)成分

用GC/MS對茶樹油進(jìn)行定量分析，通過圖譜(見圖1)解析及相關(guān)資料查詢，將各成分列于表2中.

表1 廣西玉林引種互葉白千層茶樹油的理化常數(shù)Table 1 Physical and chemical constants of tea tree oil from Melaleuca alternifolia planted in Yulin，Guangxi，China

圖1 茶樹油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ionic chromatogram of tea tree oil

表2 茶樹油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 2 Results of chemical components of tea tree oil

從表2中可知，1，8-桉葉素是廣西玉林茶樹油的主要成分，相對含量高達(dá)72.49%，屬于桉型茶樹油［7］.一般所說的澳洲茶樹油屬于4-松油醇型，國際標(biāo)準(zhǔn)ISO規(guī)定其4-松油醇的相對含量在30.0% ～48.0%之間，1，8-桉葉素相對含量須小于 15%［9］.廣西玉林從澳大利亞引種的互葉白千層茶樹通過十年精選培育，不斷改良，其茶樹油中的1，8-桉葉素相對含量大大增加，而特征成分4-松油醇、α-松油烯、γ-松油烯和異松油烯的相對含量分別降低到不足1%，這說明引種的澳洲茶樹極有可能已經(jīng)發(fā)生了變種.

2.3 茶樹油的抑菌活性與最小抑菌濃度

選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，研究不同體積分?jǐn)?shù)茶樹油的抑菌活性，抑菌圈直徑測試結(jié)果見表3.由表3中可知，茶樹油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有很強的抑菌活性，即使茶樹油體積分?jǐn)?shù)由100%下降到5%，其抑菌活性下降的幅度也不到50%.

表3 不同體積分?jǐn)?shù)茶樹油的抑菌效果1)Table 3 Antimicrobial effect of tea tree oil with different volume fractions

一般認(rèn)為，茶樹油的抑菌物質(zhì)應(yīng)該是4-松油醇等成分，所以ISO標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定4-松油醇的相對含量要高于30.0%.文中所研究的引種茶樹油幾乎不含4-松油醇，卻仍具有強烈的抑菌作用，這說明該茶樹油與原種澳大利亞互葉白千層茶樹油存在差別，其中起抑菌作用的成分極有可能不是4-松油醇.引種茶樹油具體的抑菌成分有待進(jìn)一步研究.

用混合藥劑法測得的茶樹油的最小抑菌濃度見表4.由表4可以看出，茶樹油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度相同，均為4.00 mL/L，與抑菌圈直徑的實驗結(jié)果相吻合.

2.4 茶樹油抑菌活性的穩(wěn)定性

通常，受測物的抑菌活性會受到pH值、無機鹽含量等因素的影響.文中考察了在不同pH值、不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽或蔗糖存在下茶樹油抑菌活性的變化，并對其抑菌活性的穩(wěn)定性進(jìn)行評價.

表4 茶樹油的最小抑菌濃度測定結(jié)果1)Table 4 Measured MICs of tea tree oil

2.4.1 培養(yǎng)基pH值對茶樹油抑菌活性的影響

培養(yǎng)基pH值對茶樹油抑菌活性影響的實驗數(shù)據(jù)見表5.由表5可以看出，茶樹油的抑菌活性具有較寬的pH值范圍.在pH=5～10范圍內(nèi)，當(dāng)茶樹油添加量為2.67mL/L時，能較好地抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，且隨著pH值的升高，抑菌活性先減弱后增強.這是由于培養(yǎng)基的強酸強堿性不利于細(xì)菌的生長，再加上茶樹油的抑菌作用，兩者綜合就增強了其抑菌效果.而吐溫-80添加量(每升凝膠體系中含有的純吐溫-80的量)為2.67 mL/L的對照樣品沒有表現(xiàn)出抑菌活性.

表5 培養(yǎng)基pH值對茶樹油抑菌活性的影響1)Table 5 Effect of pH value of culture medium on antimicrobial activity of tea tree oil

2.4.2 蔗糖對茶樹油抑菌活性的影響

蔗糖對茶樹油抑菌活性影響的實驗數(shù)據(jù)見表6.從表6中可以看出，當(dāng)茶樹油添加量為2.67 mL/L時，若蔗糖用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，余同)大于5%，則隨著蔗糖用量的增大，抑菌效果逐漸加強;蔗糖用量為30%和40%時，完全無菌生長.結(jié)果表明，茶樹油與蔗糖之間應(yīng)該存在協(xié)同作用.

2.4.3 食鹽對茶樹油抑菌活性的影響

食鹽對茶樹油抑菌活性影響的實驗數(shù)據(jù)見表7.從表7中可知，當(dāng)茶樹油添加量為2.67mL/L時，若食鹽用量大于2%，則隨著食鹽用量的增加，培養(yǎng)皿中大腸桿菌的生長程度明顯減弱;食鹽用量為4%時，大腸桿菌完全受到抑制;而當(dāng)食鹽用量僅為1%時，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果大大增強;當(dāng)食鹽用量為3%以上時，金黃色葡萄球菌完全不生長.這說明食鹽和桉型茶樹油對金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用較對大腸桿菌明顯.

表6 蔗糖用量對茶樹油抑菌活性的影響1)Table 6 Influence of sucrose dosage on antimicrobial activity of tea tree oil

表7 食鹽用量對茶樹油抑菌活性的影響1)Table 7 Influence of salt dosage on antimicrobial activity of tea tree oil

3 結(jié)語

用GC/MS分析得出廣西玉林引種茶樹油的18種主要化學(xué)成分及其相對含量，通過與ISO標(biāo)準(zhǔn)中4-松油醇型茶樹油化學(xué)成分相對含量的對比，發(fā)現(xiàn)廣西玉林種植基地的互葉白千層茶樹在經(jīng)過10年的種植以后極有可能已經(jīng)發(fā)生了變異，由4-松油醇型茶樹轉(zhuǎn)變?yōu)榱髓裥筒铇?茶樹雖然可能發(fā)生了變異，但其所產(chǎn)的茶樹油仍有很強的抑菌活性.文中還發(fā)現(xiàn)，桉型茶樹油在pH=5～10范圍內(nèi)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有較強的抑制作用，而一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽及蔗糖與茶樹油之間存在明顯的協(xié)同抑菌作用，這對茶樹油的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)意義.

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