張斐飛,張丹妮,鄭宇強(qiáng),岑璐局,朱妙琴

(浙江外國(guó)語(yǔ)學(xué)院理工學(xué)院,浙江杭州310012)

1 前 言

芹菜異名藥芹、旱芹,屬傘形花科的一年生或二年生草本植物,是一種豐富的自然資源.芹菜含有多種化學(xué)成分,除了含有豐富的營(yíng)養(yǎng)元素外,芹菜中還含有多種生理活性的物質(zhì),主要包括:黃酮類物質(zhì)、揮發(fā)油化合物、不飽和脂肪酸、氨基酸、香豆素衍生物、葉綠素、膳食纖維等多種物質(zhì).祖國(guó)醫(yī)學(xué)證明,芹菜性涼味甘、具有止血、平肝、祛風(fēng)、利濕、鎮(zhèn)靜降壓等功效,可治療高血壓、血管硬化、神經(jīng)衰弱、咳嗽痰多、小便淋痛、黃疸等癥[1].

目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)芹菜的研究主要集中在揮發(fā)油和黃酮類化學(xué)成分以及生理功能上[2].芹菜作為一種常食蔬菜,人們經(jīng)常食用其莖而對(duì)芹菜葉沒有進(jìn)行充分的利用.本文測(cè)定了芹菜葉提取物在較佳提取工藝條件下的黃酮含量;此外分別用紫外可見光譜和熒光光譜研究了芹菜葉提取物對(duì)羥自由基的清除性能,以期為芹菜葉提取物的開發(fā)利用提供一些參考數(shù)據(jù).

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與材料

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司),FP-6000熒光光譜儀(日本Jisac公司)芹菜(杭州市市售)將芹菜葉洗凈,自然風(fēng)干數(shù)天,將其磨成細(xì)粉,密閉、避光儲(chǔ)存,備用.蘆丁(生化試劑),其它試劑均為分析純.

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 提取條件的選擇

[3],用控制變量法確定芹菜葉提取物的較佳提取工藝.變量分別為:提取劑(乙醇的體積分?jǐn)?shù))、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比.通過采用清除羥自由基活性——Fenton實(shí)驗(yàn),測(cè)定在510nm處的吸光度,得出芹葉提取物較佳提取工藝為:體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液,料液比為1∶18(質(zhì)量比),室溫普通震蕩提取50min,提取3次.

2.2.2 提取液葉綠素的去除

取潔凈的干燥管,少量棉花放入氣泡下端,將活性碳裝在干燥管中,將提取液從干燥管進(jìn)口倒入,讓其進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,重復(fù)吸附3次即可以將葉綠素除去.將除去葉綠素的提取液轉(zhuǎn)移到100mL的容量瓶中,用85%的乙醇溶液定容至刻度待用.

2.2.3 黃酮含量的測(cè)定

2.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品,采用亞硝酸鈉-氯化鋁比色法[4].先用蘆丁對(duì)照品配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.得回歸方程:A=0.38238m-0.00392,相關(guān)系數(shù)r=0.9979.式中A為吸光度,m為蘆丁的質(zhì)量.鋁鹽絡(luò)合分光光度法測(cè)定總黃酮的原理為:在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下,黃酮類化合物與鋁鹽生成螯合物,加入氫氧化鈉溶液后顯紅色,在510nm波長(zhǎng)處有吸收峰且符合定量分析的比爾定律.

2.2.3.2 芹菜葉總黃酮含量的測(cè)定

稱取1.6372g芹菜葉細(xì)粉,在2.2.1提取條件下提取,提取液定容至100mL.取10mL比色管7支,分別加入芹菜葉提取液2.0mL,50g/L NaNO21mL,搖勻,放置5min后加入62.5g/L AlCl31.0mL,搖勻,放置5min,再加入40g/L NaOH 10mL,加蒸餾水至刻度,混勻,15min后用分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)510nm處測(cè)定其吸光度,結(jié)果見表1.

表1 芹菜葉提取液總黃酮含量

表1數(shù)據(jù)表明:吸光度的重現(xiàn)性較好,用紫外分光光度法測(cè)芹菜葉提取物中黃酮類化合物的含量,標(biāo)準(zhǔn)偏差0.053和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.009均較小,所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠.將結(jié)果代入回歸方程,得知芹菜葉總黃酮的含量為1.67mg/g.

2.2.4 Fenton-Fe2+-H2O2體系紫外光度法清除羥自由基實(shí)驗(yàn)

Fe2+-2H2O2體系通過芬頓(Fenton)反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基(·OH).反應(yīng)原理如下:

鄰二氮菲-Fe2+水溶液因被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+溶液,在510nm處的吸光度減小.加入H2O2前加入芹菜葉提取液,則Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被抑制或部分抑制,體系在510nm處的吸光度降低程度減小.

取10mL比色管,依次加入1.0mL pH=7.4的KH2PO4-NaOH溶液,0.30mL 7.5mmol/L硫酸亞鐵銨溶液和0.30 mL 7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液,1號(hào)比色管中直接用蒸餾水定容至刻度;2號(hào)比色管加入0.20mL 7.5 mmol/L過氧化氫溶液后蒸餾水定容至刻度;3號(hào)比色管中分別加入芹菜葉提取物和過氧化氫溶液后用蒸餾水定容至刻度.在37℃水浴中放置1h,在最大吸收波長(zhǎng)510nm下測(cè)吸光度,計(jì)算對(duì)羥自由基的清除率,結(jié)果見表2.從表2數(shù)據(jù)可以看出:芹菜葉提物對(duì)羥自由基有清除作用,隨著提取液的用量增加,清除率也隨著增大,當(dāng)加入提取液增加到4mL后,清除率基本穩(wěn)定下來(lái),說明清除作用會(huì)達(dá)到飽和.參考文獻(xiàn)[4],計(jì)算自由基清除率如下:自由基清除率(%)=(A3-A2)/(A1-A2)×100%.式中,A1和A2分別為體系不加過氧化氫和加過氧化氫時(shí)的吸光度,A3為加入芹菜葉提取液后的吸光度.

表2 芹菜葉提物對(duì)羥自由基的清除

2.2.5 羅丹明B-Mn2+-H2O2同步熒光光度法清除羥自由基實(shí)驗(yàn)

羅丹明B能產(chǎn)生特征熒光,弱堿性介質(zhì)中Mn2+-2H2O2體系產(chǎn)生的羥自由基可迅速氧化羅丹明B使熒光猝滅,而加入芹菜葉提取液后可部分清除溶液中羥自由基,從而使其熒光猝滅程度減弱.

參考文獻(xiàn)[5],在10mL比色管中,依次加入0.5mL 1×10-2g/L羅丹明B溶液,pH=9.0的氨水-NH4Cl緩沖溶液1.5mL,0.25mol/L的硫酸錳溶液0.50mL,0.6%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液0.40mL,定容至刻度并搖勻;于40℃的水浴中放置15min,用冰水冷卻3min.以Δ λ=21nm同步掃描,測(cè)定574nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度F,計(jì)算其與空白溶液(羅丹明B加緩沖溶液)熒光強(qiáng)度F0之差ΔF,通過測(cè)定ΔF變化,間接測(cè)定羥自由基的產(chǎn)生量.于試管中先加入一定量的羥自由基清除劑(芹菜葉提取液),再加入羅丹明B、pH=9.0的氨水-NH4Cl緩沖溶液、MnSO4溶液及過氧化氫,測(cè)定熒光強(qiáng)度Fs;羅丹明B加緩沖溶液作為空白參比,其熒光強(qiáng)度為F0;未加清除劑的體系其熒光強(qiáng)度為F.計(jì)算清除率,數(shù)據(jù)見表2及圖1.

圖1 同步熒光分光光度法清除羥自由基

表3 羅丹明B-Mn2+-2H2O2體系芹菜葉提取液對(duì)羥自由基的清除率

表3和圖1表明:隨著加入提取液量的增加,自由基的清除率也隨著增大,說明芹菜葉提取液對(duì)羥自由基有較好的清除作用.

3 小 結(jié)

(1)在較佳提取條件下,芹菜提取液中的黃酮含量為1.67mg/g.

(2)紫外和熒光實(shí)驗(yàn)表明:芹菜葉提取物對(duì)羥自由基有很好的清除作用,羥自由基清除率最大分別可達(dá)81.69%和64.52%.

(3)從資源的綜合利用考慮以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:芹菜葉提取物可以作為天然抗氧化劑加以開發(fā)利用.

參考文獻(xiàn):

[1]周輝,盧向陽(yáng).芹菜的化學(xué)成分和藥理活性[J].氨基酸和生物資源,2006,28(1):6-8.

[2]閆向陽(yáng),楊喜平.芹菜黃酮提取及其對(duì)油脂抗氧化性研究[J].糧食與油脂,2006,24(4):24-26.

[3]朱妙琴,朱錢鋒.植物超聲提取物抗氧化成分的光譜分析比較[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2008,25(2):88-90.

[4]郭亞力,李聰,歐靈澄,等.3種分光光度法對(duì)天然抗氧化物質(zhì)抗自由基性能的分析檢測(cè)[J].分析試驗(yàn)室,2004,23(10):43-48.

[5]張愛梅,劉妮娜,臧運(yùn)波,等.羅丹明B-Mn2+-2H2O2體系同步熒光分光光度法測(cè)定中藥的抗氧化活性[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè),2007,43(4):280-282.