林貞賢，盧繼承

(泰山學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)系，山東泰安 271021)

蛙心灌流實(shí)驗(yàn)中因蛙心具有制備容易、不需恒溫、充氧及蛙心存活時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，普遍應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)教學(xué)及科學(xué)研究，也是研究觀察各種生物活性物質(zhì)及藥物的重要的手段之一［1－2］.實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵在于離體心臟標(biāo)本存活時(shí)間和功能狀態(tài).良好的心肌活性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性尤為重要，為彌補(bǔ)傳統(tǒng)蛙心灌流實(shí)驗(yàn)中插管難度大，蛙心存活時(shí)間短的不足，我們對(duì)蛙心灌流實(shí)驗(yàn)從器材到技術(shù)方法進(jìn)行了改進(jìn)，并取得良好的效果.

1 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法

目前，生理學(xué)中常采用經(jīng)典的斯氏法和八木氏法.斯氏法只插單管，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但需將套管從主動(dòng)脈經(jīng)過(guò)動(dòng)脈瓣插入心室，心室收縮時(shí)灌流液進(jìn)入插管，心室舒張時(shí)灌流液又回流到心室，并非心臟單方向泵血模型，勢(shì)必影響心臟的生理特性，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度降低，且插管時(shí)易造成心臟瓣膜及心肌損傷，不能觀察心臟泵血功能的自身調(diào)節(jié)，心律失常發(fā)生率高，實(shí)驗(yàn)失敗率高［3］.八木氏法需要對(duì)腔靜脈和主動(dòng)脈分別進(jìn)行插管，與心臟血液?jiǎn)畏较蛄鲃?dòng)一致，符合心臟工作模式，不通過(guò)主動(dòng)脈瓣，對(duì)主動(dòng)脈瓣及心室肌的損傷機(jī)會(huì)減小，但是操作時(shí)間長(zhǎng)，更換某種因素時(shí)不易將前一種因素徹底清除，裝置復(fù)雜、需定制、費(fèi)用高，僅用于觀察前負(fù)荷、后負(fù)荷對(duì)心輸出量的影響［3］.兩種實(shí)驗(yàn)方法所用插管和灌流裝置均為玻璃制品，不僅容易損壞，而且不易操作，記錄裝置都要用蛙心夾和張力換能器，對(duì)蛙心有一定的損傷，會(huì)影響蛙心收縮力和心輸出量，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確.

由于上述方法存在不足，目前關(guān)于蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置的改進(jìn)有:一種簡(jiǎn)單、新型的主要用于蛙心灌流實(shí)驗(yàn)的計(jì)滴裝置［4］和一種自制的新型計(jì)滴器［5］.這兩種改進(jìn)實(shí)際上都是一種計(jì)滴裝置，心臟收縮時(shí)任氏液由動(dòng)脈插管經(jīng)阻力管進(jìn)入計(jì)滴槽，心臟舒張時(shí)，槽內(nèi)液體經(jīng)靜脈插管回流入心臟，形成離體蛙心的體外循環(huán).進(jìn)入計(jì)滴槽的液滴經(jīng)過(guò)兩個(gè)記錄電極瞬間，由點(diǎn)滴換能器轉(zhuǎn)換為方波輸入計(jì)算機(jī)顯示、記錄和計(jì)測(cè).通過(guò)滴數(shù)的變化來(lái)判定某種因素對(duì)蛙心功能的影響，也都獲得了較好的效果，但當(dāng)蟾蜍(或青蛙)心搏頻率很快、搏出量較大時(shí)，此時(shí)計(jì)滴器電路可出現(xiàn)滴液滯留持續(xù)連電而短路的現(xiàn)象.

2 新型蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置

我們經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)研制成功一種新型蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置，該裝置已獲國(guó)家實(shí)用新型專利授權(quán)(專利號(hào):ZL 200920029387.8)，該裝置具有插管容易，蛙心存活時(shí)間長(zhǎng)，蛙心工作模式直觀性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn).現(xiàn)就有關(guān)該裝置的制作、技術(shù)方案及使用做以簡(jiǎn)介.

2.1 新型蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置的制作

將一次性靜脈輸液針一端剪去注射針，在輸液管插入帶有斜面的硬塑料管(兒童口服液的吸管)，制成右動(dòng)脈插管、左動(dòng)脈插管和靜脈插管，在右動(dòng)脈插管的一端加上流量可調(diào)的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān).將一次性靜脈輸液的刻度滴斗用記號(hào)筆標(biāo)記刻度，在滴斗頂部打上Φ2mm左右的通氣孔和插上輸液針頭(加藥用)，制成計(jì)滴器.蛙板、2個(gè)高低調(diào)節(jié)架、4根插管、計(jì)滴器及血壓換能器組成了蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置，見(jiàn)下圖1.

2.2 新型蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置的技術(shù)方案

本蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置所采取的技術(shù)方案為:用注射器通過(guò)換能器充液管給生理壓力傳感的壓力倉(cāng)充滿任氏液，讓氣泡通過(guò)左主動(dòng)脈插管排凈，用動(dòng)脈夾夾閉充液管.左肝靜脈(或后腔靜脈)插入靜脈插管，其接頭與刻度滴斗的下口相連，刻度滴斗的上端有加液針頭和通氣孔;右主動(dòng)脈插入右主動(dòng)脈插管，固定在高低調(diào)節(jié)架上，其接頭與刻度滴斗上口的調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)相連，形成體外循環(huán)系統(tǒng)，固定在支架Ⅰ上;左主動(dòng)脈插入左主動(dòng)脈插管，其接頭與生理壓力傳感器連接，固定在支架Ⅱ上，其高度與蛙心相同，通過(guò)血壓換能器導(dǎo)線連接生物信號(hào)采集系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)，通過(guò)計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)觀測(cè)及記錄改變激素和電解質(zhì)對(duì)蛙心功能的影響，還可通過(guò)刻度滴斗觀察記錄滴數(shù)，記錄心輸出量.

1.高低調(diào)節(jié)架 2.右主動(dòng)脈插管 3.調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān) 4.通氣孔5.加液針頭 6.刻度滴斗 7.靜脈插管 8.支架Ⅰ9.蛙板 10.左主動(dòng)脈插管 11.血壓換能器 12.血壓換能器導(dǎo)線13.換能器充液管 14.動(dòng)脈夾 15.支架Ⅱ圖1

2.3 制備蟾蜍在體心臟灌流標(biāo)本

選擇體重大、精神佳的蟾蜍，雙毀髓，背位固定于蛙板上，開(kāi)胸暴露心臟.辨認(rèn)心室、心房、左肝靜脈(后腔靜脈)、右主動(dòng)脈、左主動(dòng)脈［6］.分離左、右主動(dòng)脈和左肝靜脈(后腔靜脈)，用線結(jié)扎除了這3根血管以外的全部血管(主要是左、右肺靜脈)和神經(jīng).自左肝靜脈(后腔靜脈)插入充滿0.4%肝素－任氏液的靜脈插管，其接頭與刻度滴斗的下口相連.由右主動(dòng)脈插入右動(dòng)脈插管，其接頭與調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)相連，形成一個(gè)在體的蛙心循環(huán).由左主動(dòng)脈插入左主動(dòng)脈插管，其接頭與壓力換能器相連，用于監(jiān)測(cè)改變激素和離子對(duì)心功能的影響，記錄主動(dòng)脈壓、觀察刻度滴斗內(nèi)的滴數(shù)記錄心輸出量.

3 結(jié)果

用此裝置觀察了前、后負(fù)荷以及激素、電解質(zhì)對(duì)心輸出量的影響.結(jié)果如下:

3.1 前負(fù)荷對(duì)心功能的影響

圖2

前負(fù)荷，即心臟收縮之前承受的負(fù)荷，用刻度滴斗內(nèi)液面與蛙心的距離(cmH2O)表示.固定后負(fù)荷10cmH2O不變，分別依次控制前負(fù)荷為4、5、6、7cmH2O，隨前負(fù)荷增加，心輸出量相應(yīng)增加，如圖2所示.

3.2 后負(fù)荷對(duì)心功能的影響

圖3

后負(fù)荷為心臟射血所遇到的阻力.固定前負(fù)荷為4cmH2O不變，通過(guò)改變裝置中的高低調(diào)節(jié)架的高度，分別控制后負(fù)荷為10、12、14、17cmH2O，心輸出量隨之增加，當(dāng)增至17cmH2O時(shí)輸出量卻減小，即此時(shí)后負(fù)荷超過(guò)最適后負(fù)荷［6］，如圖3所示.

3.3 腎上腺素和乙酰膽堿對(duì)心功能的影響

圖4

固定前、后負(fù)荷，由加液針頭處加入2～4滴腎上腺素溶液(1:5000).當(dāng)觀察到心縮力加強(qiáng)，心率加快時(shí)，心輸出量增大，拔開(kāi)調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)上端的接口，放掉含腎上腺素的灌流液，并用任氏液反復(fù)沖洗幾次，使灌流液液面保持原來(lái)的高度，待心搏恢復(fù)正常后，加入2～3滴乙酰膽堿溶液(1:10000)后，心跳則減慢，心收縮幅度減小，心輸出量下降.表明腎上腺素可增強(qiáng)心泵功能，乙酰膽堿則降低，如圖4所示.

3.4 Na+、K+、Ca2+對(duì)心功能的影響

圖5

固定前、后負(fù)荷，由加液針頭處加入1～2滴0.65%NaCl溶液，心率減慢，心肌收縮活動(dòng)減弱，待曲線明顯變化時(shí)，立即拔開(kāi)調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)上端的接口，并用新鮮的任氏液沖洗2～3次，待心搏恢復(fù)正常.再向刻度滴斗加入1～2滴2%CaCl2溶液，出現(xiàn)反應(yīng)(心收縮力加強(qiáng)，心率加快)后，立即沖洗，換液，待恢復(fù)正常后加入1～2滴1%KCl溶液，可看到心跳明顯減弱，心肌收縮減慢［6］.Na+使心輸出量減少，Ca2+則增加，K+則減少，如圖5所示.

4 討論

該新型灌流裝置與經(jīng)典的八木氏法原理基本相似，作者采用離體蛙心灌流法，用我們的裝置制成一個(gè)在體蛙心循環(huán)系統(tǒng).在體心臟處于一個(gè)完整的有機(jī)體，更有利蛙心活力的保持，缺點(diǎn)是任一因素的干涉都會(huì)引起其他因素的改變，不能觀察單一因素對(duì)心功能的影響.本實(shí)驗(yàn)利用在體在位的蟾蜍心臟，通過(guò)結(jié)扎神經(jīng)消除了神經(jīng)反射對(duì)心率變動(dòng)的影響，其準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)的記錄方法或其他改良裝置的測(cè)量結(jié)果相一致［6－8］.

該實(shí)用新型優(yōu)點(diǎn)一是所有插管均為塑料軟管帶硬塑料插頭，解決了八木氏插管難度大，成功率低的問(wèn)題.二是蛙心記錄裝置為壓力換能器，解決了蛙心夾對(duì)蛙心的損傷，避免了為調(diào)節(jié)方位和角度反復(fù)使用蛙心夾導(dǎo)致蛙心尖破裂的現(xiàn)象.三是蛙心存活時(shí)間更長(zhǎng)，筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)蛙心存活可長(zhǎng)達(dá)6小時(shí)以上，從而能夠保證多個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察項(xiàng)目的順利完成.四是在觀察施加某種因素前后心臟功能的變化的同時(shí)，還可直接觀察到蛙心主動(dòng)脈血壓變化情況，這是斯氏或八木氏離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)無(wú)法比擬的.

該實(shí)驗(yàn)在充灌液體時(shí)應(yīng)注意，與壓力傳感器相連的動(dòng)脈插管端垂直向上，從壓力傳感器的充液管推入抗凝用肝素任氏液，使壓力感受器和動(dòng)脈插管的氣泡要完全排除，因氣泡具有較大的可收縮性，可緩沖動(dòng)脈血壓，影響動(dòng)脈血壓的準(zhǔn)確性.氣泡排凈后，用動(dòng)脈夾夾閉充液管，除調(diào)零外不再打開(kāi).在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，如血液不慎進(jìn)入壓力傳感器中造成血凝而影響血壓的正常記錄，要夾閉動(dòng)脈近心端，取下動(dòng)脈插管，清洗壓力換能器再重新插管記錄血壓［8］.因兩棲類具有心搏頻率慢、搏出量小、動(dòng)脈血壓較低等特點(diǎn)，所以每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)沖洗后應(yīng)保持一定的前負(fù)荷和后負(fù)荷，否則動(dòng)脈壓過(guò)低，信號(hào)小，增益過(guò)大，影響血壓換能器記錄結(jié)果的準(zhǔn)確性，這是本實(shí)驗(yàn)裝置的一個(gè)不足.另外，要維持刻度滴斗內(nèi)一定液面，若液面低于刻度滴斗與靜脈插管的連接處，空氣易進(jìn)入心臟形成氣栓，影響液體循環(huán).

本實(shí)驗(yàn)裝置也可通過(guò)觀察刻度滴斗內(nèi)的液滴數(shù)來(lái)記錄心輸出量，還可以用針型電極刺入右前肢，左右后肢皮下，同步記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)ECG，可同時(shí)監(jiān)視蛙心心電圖，所以本套實(shí)驗(yàn)裝置改進(jìn)及使用仍有提高的空間.自2009年來(lái)我們實(shí)驗(yàn)室均采用此新型蛙心灌流實(shí)驗(yàn)裝置用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)，用其開(kāi)展實(shí)驗(yàn)具有結(jié)果準(zhǔn)確，蛙心工作模式直觀性強(qiáng)，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本的效果，還能提高學(xué)生興趣，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力.

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