樊占兵，李 明，魏雙江，秦彩娟，肖慶旺

河北省灤縣人民醫(yī)院普外一科，河北灤縣 063700

黃芪注射液是我國開發(fā)的一種中藥制劑，目前在臨床上已得到廣泛運用，能提高患者免疫力。有關(guān)黃芪注射液抗腫瘤作用的相關(guān)研究，國內(nèi)外報道非常少。本文將黃芪注射液對人結(jié)腸癌SW480細胞體外抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用實驗結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

流式細胞儀(Bechman Coulter公司，EPICS-XL型)；Bio-Tek酶聯(lián)免疫檢測儀 (PE公司，型號ELX-800)；人結(jié)腸癌SW480細胞(中國科學(xué)院上海細胞生物所)；黃芪注射液(成都地奧九泓制藥廠，批號：9709008)；奧沙利鉑(L-OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司)；小牛血清(浙江省杭州四季青生物公司)；四甲基噻唑氮藍(MTT，F(xiàn)luka公司)；二甲基亞砜(SIGMA 公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；RPMI1640培養(yǎng)液(美國GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)(美國Sigma公司)；

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SW480細胞用加10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT法檢測對數(shù)生長期SW480細胞 實驗分為空白對照組、奧沙利鉑對照組（20 μg/ml）和黃芪注射液實驗組（125、250、500、1 000 μg/ml），每組設(shè) 3 個復(fù)孔，以不含細胞的RPMI 1640培養(yǎng)液為空白對照組(調(diào)零組)，各組細胞按不同處理后培養(yǎng)48 h，檢測時加入20 μl MTT（濃度為5 mg/ml），繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加二亞基甲砜150 μl，振蕩溶解，酶聯(lián)檢測儀測定570 nm波長處的吸光度OD值（λ=570nm）。細胞增殖抑制率計算：細胞抑制率(%)=[（對照組OD-實驗組OD）/對照組 OD]×100%。

1.2.3 PI細胞染色FCM法檢測SW480細胞凋亡 取常規(guī)傳代的SW480細胞，每組3瓶，用含0.1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基處理24 h進行細胞周期同步化后，分別加入不同濃度的藥物。培養(yǎng)48 h對數(shù)生長期收集細胞，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，振蕩，無菌PBS洗滌，重復(fù)3次。振蕩后加入-4℃的95%乙醇1 ml固定，上流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)取α=0.05，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

普通高倍顯微鏡400倍下觀察，加藥后SW480細胞數(shù)量減少，細胞體積縮小，變圓，折光性差，細胞脫落漂浮，胞漿濃縮，核染色質(zhì)固縮，細胞核碎裂。

2.2 MTT法檢測黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用

與空白對照組比較，125 μg/ml以上濃度的黃芪注射液對SW480細胞生長增殖有明顯的抑制作用，且與作用濃度呈正比（P=0.000＜0.01）。 結(jié)果見表1。

表1 MTT法測定黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用（±s，n=3）

表1 MTT法測定黃芪注射液對SW480細胞的抑制作用（±s，n=3）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01

組別空白對照組奧沙利鉑對照組黃芪注射液實驗組125 μg/ml 250 μg/ml 500 μg/ml 1 000 μg/ml OD 值（λ=570 nm）1.372±0.001 0.897±0.012 1.177±0.213 0.891±0.013 0.690±0.089 0.383±0.141抑制率（%）0 34.6*14.2*35.1*49.7*72.1*

2.3 流式細胞儀FCM法分析結(jié)果

空白對照組SW480細胞自然凋亡率為0.86%，奧沙利鉑20 μg/ml對照組凋亡率為9.41%，黃芪注射液作用SW480細胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各組的凋亡率分別為24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。細胞周期分析提示，加用黃芪48 h后G1期細胞數(shù)量增多，S期細胞數(shù)量減少，黃芪注射液使SW480細胞的生長停滯在G1期，并且促進G1期細胞凋亡，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性。統(tǒng)計分析表明125 μg/ml以上濃度的黃芪注射液組SW480細胞凋亡率較空白對照有明顯升高，有顯著性差異（P=0.000＜0.01）（表2）。

表2 FCM法分析黃芪注射液對SW480細胞周期和凋亡率的影響（%）

3 討論

黃芪注射液是常用的一種補氣用藥制劑，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表等功效。黃芪中含有黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類、多種氨基酸及鐵、錳、鋅、硒等多種微量元素。這些成分具有不同的生物學(xué)活性，如清除氧自由基，增加巨噬細胞吞噬病毒的抗病毒能力，具有多方面的免疫調(diào)節(jié)和免疫增強作用，具有雙向調(diào)節(jié)免疫功能，是一種免疫調(diào)節(jié)劑[1-3]，提高機體抗病能力。目前大多數(shù)研究人員認為黃芪抗癌作用并非藥物直接殺滅癌細胞，而是通過對機體的免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)淋巴細胞產(chǎn)生IL-2和IFN，直接或間接參與細胞因子和免疫系統(tǒng)的調(diào)控，從而達到誘導(dǎo)癌細胞凋亡。據(jù)報道[4-9]黃芪注射液可以用于大腸癌患者手術(shù)化療后免疫功能低下的治療，增強化療藥物療效，減少細胞毒性藥物的損傷，保護骨髓維護造血功能，提高患者生存質(zhì)量，延長生存期，取得較佳治療效果。

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居肺癌、乳腺癌之后而占第三位。近年各地資料顯示其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康與生命[10]。目前常用的化療藥物存在選擇性低，毒性大，價格貴，易產(chǎn)生耐藥性等缺陷。因此尋找靶向性強，毒性低，價格優(yōu)惠，分子量小，易穿透腫瘤組織的新型藥物是抗腫瘤新藥開發(fā)研究的發(fā)展方向。大多數(shù)化療藥物都通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，因此其可能是不同機制抗癌藥物發(fā)揮作用的共同通路[11]。劉成軍等[12]報道黃芪注射液能抑制人類小涎腺腺樣囊性癌細胞株增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。李瓊等[13]發(fā)現(xiàn)黃芪注射液對人乳腺癌細胞株MDAMB-435的體外增殖具有抑制作用。Tin等[14]研究表明黃芪可以作為結(jié)腸癌有效的化療制劑或配合傳統(tǒng)化療治療結(jié)腸癌，目前機制不明。因此我們嘗試應(yīng)用黃芪注射液行體外實驗，探討其是否誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細胞凋亡，尋找其作用機制。

本實驗以不同濃度的黃芪注射液不同時間直接作用于人結(jié)腸癌SW480細胞株，普通光鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示癌細胞數(shù)量減少，細胞體積縮小，變圓，折光性差，細胞脫落漂浮，胞漿濃縮，核染色質(zhì)固縮，細胞核碎裂。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液對SW480細胞生長增殖有明顯的抑制作用，且與作用濃度呈正比。本實驗還通過FCM法檢測黃芪注射液對SW480細胞生長周期的影響，結(jié)果表明對照組SW480細胞自然凋亡率為0.86%，黃芪注射液作用SW480 細胞 48 h 后，125、250、500、1 000 μg/ml各組的凋亡率分別為24.2%、42.6%、64.1%、84.0%。細胞周期分析顯示實驗組黃芪注射液對人結(jié)腸癌SW480細胞的體外增殖具有抑制作用，并能促使SW480細胞阻滯于G1期，誘導(dǎo)SW480細胞凋亡。本研究為黃芪注射液用于臨床治療大腸癌患者提供了有力的依據(jù)。

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