袁 偉，董 娜，張麗芳，林樹柱，向志光，喬紅偉，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌。隨著多重耐藥菌、極度耐藥株的出現(xiàn)，艾滋病與結(jié)核共感染人群的增加使得活動性結(jié)核病人日益增多［1］?？ń槊纾˙CG）用于預(yù)防結(jié)核病已有80多年的歷史，在世屆衛(wèi)生組織免疫接種擴(kuò)大方案中，卡介苗作為目前唯一的結(jié)核病疫苗正在廣泛使用。它雖然可以極好地預(yù)防幼兒粟粒性結(jié)核和結(jié)核腦膜炎，但不能預(yù)防結(jié)核病的最流行形式——成人肺結(jié)核，因此研究更為有效的 TB新型疫苗對TB的防治有著重要的意義。隨著MTB基因組測序的完成和比較基因組學(xué)的研究進(jìn)展，人們通過基因工程技術(shù)改造BCG，或研究亞單位疫苗、基因疫苗、載體活疫苗等新型疫苗，或與BCG聯(lián)合建立組合型疫苗，采用基礎(chǔ)-加強(qiáng)型免疫策略等，以解決BCG的免疫力不足，以及其對成人保護(hù)性差和缺乏清除潛伏菌等問題。

有效、特異的保護(hù)性抗原是疫苗成功的一個重要因素，近年來，隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展，不斷的有新抗原被發(fā)現(xiàn)和鑒定，目前，研究較多的結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原有M tb8.4、M tb32、TB10.4、MPT64和38kD蛋白（PstS-1）等，國際上正在進(jìn)行臨床研究的結(jié)核病疫苗采用的抗原主要是 Ag85、ESAT-6和M tb72F等。HspX是一種相對分子質(zhì)量為16000的小分子熱休克蛋白家族，由基因 hspx（rv2031c）表達(dá)，屬于結(jié)核菌休眠期調(diào)控子（DosR regulon）。HspX是結(jié)核分枝桿菌在靜止生長期或低氧狀態(tài)下產(chǎn)生的主要蛋白，有研究表明HspX在結(jié)核分枝桿菌感染后短時間內(nèi)減緩其在體內(nèi)生長速度方面可能起到某種關(guān)鍵作用［2］。本研究選擇了結(jié)核重要的保護(hù)性抗原Ag85B和ESAT-6，以及休眠期細(xì)菌特有的抗原HspX，構(gòu)建了 Ag85B-Esat6-HspX重組質(zhì)粒，并將其免疫BALB/c小鼠，對其免疫原性了進(jìn)行評價，進(jìn)而為此疫苗的效力學(xué)評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及蛋白

凍干皮內(nèi)注射用卡介苗（BCG）購于成都生物制品研究所。pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX和pcDNAHspX質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存。HspX蛋白由本室純化、保存。

1.2 主要試劑

去除內(nèi)毒素（endo free）的質(zhì)粒抽提試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品（德國）。小鼠干擾素γ（IFN-γ）和白細(xì)胞介素2（IL-2）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒為美國 Biolegend公司產(chǎn)品。小鼠預(yù)包被ELISPOT試劑盒為深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c小鼠（SPF級）購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2006-0009］。鼠齡6～8周，體重18～22 g，自由飲食進(jìn)食，晝夜節(jié)律12 h。

1.4 動物分組及免疫

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為4組，每組10只：生理鹽水組 （NS，100μL）；BCG組 （1×106CFU/只）；pcDNA-HspX組 （pcDNA-HspX，100μg）、pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX 組 （pcDNA-Ag85BEsat6-HspX，100μg）。

分別在第0、2、4周用質(zhì)粒DNA一側(cè)股四頭肌肌肉注射免疫動物（100μg/只），1×106CFU BCG第0周時在頸部皮內(nèi)免疫動物1次。在免疫的第2、4周和最后一次免疫后2周，各組小鼠剪取鼠尾取血，分離血清，檢測體液免疫指標(biāo)。動物在最后一次免疫后2周處死，無菌分離脾臟淋巴細(xì)胞檢測細(xì)胞免疫指標(biāo)。

1.5 ELISA法檢測血清特異性抗體

HspX蛋白 100μL/孔（5μg/m L）包被酶標(biāo)板，4℃過夜。1％牛血清白蛋白封閉30 m in，PBST溶液300μL/well洗板5次×3 m in/次。用PBST溶液1∶500稀釋血清樣品后，100μL/well加入酶標(biāo)板，37℃孵育1 h。再次洗板后，加入100μL/well的1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠IgG，然后加入100μL/well TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15 min顯色后，加入50μL/well終止液（2 mol/L H2SO4）終止反應(yīng)，450 nm處檢測吸光度（A）值。

1.6 特異性IFN-γ和IL-2的誘導(dǎo)和測定

用含10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/m L，800μL/well加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時每孔加入80μL HspX蛋白，置5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)72 h后，收集培養(yǎng)液，5000 rpm離心5 m in，取上清液，-20℃凍存?zhèn)錂z。IFN-γ和IL-2含量的檢測用ELISA方法，以IFN-γ和IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算二者的含量。

1.7 EL ISPOT法檢測免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)

IFN-γ的水平與結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)相關(guān)，應(yīng)用ELISPOT方法檢測免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞針對特異性抗原分泌IFN-γ的能力。小鼠最后一次免疫2周后無菌分離脾臟，應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測脾細(xì)胞受到 HspX蛋白刺激后 IFN-γ的表達(dá)。ELISPOT板預(yù)先用 IFN-γ抗體包被過夜，無菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。將終濃度為5×106/m L的淋巴細(xì)胞100μL/well加入96孔ELISPOT板中，并分別給予HspX蛋白（10μg/m L）刺激，并設(shè)陰性對照，加培養(yǎng)基、不加刺激物；陽性對照，用 PMA（1 ng/ m L）刺激，共同孵育24 h后，按ELISPOT操作說明依次加入檢測抗體等試劑，洗板、顯色，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析，將疫苗免疫組結(jié)果與生理鹽水組進(jìn)行比較。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒純度和含量的測定

抽提的質(zhì)粒DNA在260 nm處與280 nm處的A值比值均在1.80以上，且經(jīng)過0.8％的瓊脂糖凝膠電泳分析，并沒有發(fā)現(xiàn)RNA的污染。

2.2 免疫小鼠血清抗HspX-IgG的測定

圖1 免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特性性抗體水平（*P＜0.05）Fig.1 Serological responses against special antigen in immunized mice（*indicates P＜0.05）

用HspX抗原刺激后，ELISA法檢測總IgG抗體結(jié)果顯示（見圖1），隨著免疫時間的增加，免疫小鼠的抗體水平持續(xù)增加，DNA免疫小鼠在最后一次免疫后2周的抗體水平最高，融合基因組（即 pAEH組）免疫小鼠血清總IgG OD值均高于其他三組（P＜0.05）。同時，單純 HspX質(zhì)粒 DNA免疫組（即pHspX組）與BCG組或生理鹽水組相比，也產(chǎn)生了較高水平的IgG（P＜0.05），表明潛伏期抗原能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。

2.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性 IFN-γ的分泌水平

BCG及各 DNA疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過 HspX抗原刺激后，可以引起特異性IFN-γ的分泌，但NS組小鼠IFN-γ分泌不明顯（圖2）。融合基因組與 BCG組、pHspX免疫組比較，差異有顯著性（P＜0.05），表明 pcDNA-Ag85BEsat6-HspX免疫小鼠后產(chǎn)生特異性的 IFN-γ水平最高。

圖2 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生的IFN-γ水平 （* P＜0.05）Fig.2 The level of IFN-γinduced in splenolymphocytes of the immunized m ice.（* indicates P＜0.05）

2.4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IL-2的分泌水平

融合基因免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞所誘生的IL-2含量也最高，為84.63±8.76 pg/m L，高于 BCG組的 37.65±2.72 pg/m L（P＜0.05）和 pHspX免疫組的42.42 ±3.61pg/m L（P＜0.05）（圖3）。

2.5 ELISPOT檢測結(jié)果

融合基因組經(jīng) HspX抗原（10μg/m L）體外刺激后分泌IFN-γ顯著升高，與pHspX組或BCG組比較，差異有顯著性（P＜0.05）；同時，pHspX組經(jīng)HspX抗原（10μg/mL）體外刺激后分泌IFN-γ也明顯升高，與 NS組比較差異有顯著性（P＜0.05）。陽性對照組（PMA刺激）分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)目和水平均較高且一致，陰性對照組（不刺激）僅見極少量的IFN-γ分泌（圖4）。

圖3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-2水平（* P＜0.05）Fig.3 The level of IL-2 induced in splenolymphocytesof the immunized mice.（* indicates P＜0.05）

3 討論

DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗。DNA疫苗不僅可引起體液免疫反應(yīng)，而且能誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，被認(rèn)為在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體感染的防治中具有更大的優(yōu)勢。DNA疫苗僅由DNA（如質(zhì)粒）或RNA（如mRNA）組成，疫苗抗原的編碼基因插入適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞質(zhì)粒DNA的始動子及終止密碼之間，它可在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制，而不能在人類宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。此質(zhì)?？捎纱竽c桿菌培養(yǎng)中純化而得到。DNA被肌肉細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在此抗原基因被轉(zhuǎn)錄，mRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并被翻譯為蛋白質(zhì)，表達(dá)特定的抗原，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

編碼單一結(jié)核分枝桿菌抗原的DNA疫苗的保護(hù)效應(yīng)一般都不及BCG，提高DNA疫苗效應(yīng)的方法除繼續(xù)篩選更為有效的保護(hù)性抗原以外，還包括多種單一抗原成分的DNA疫苗的聯(lián)合免疫，與分子佐劑如細(xì)胞因子、共刺激分子等聯(lián)合使用以及改進(jìn)免疫接種方式、途徑和程序等。Ag85B和Esat6都是結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)液分泌蛋白中具有較強(qiáng)免疫保護(hù)作用的抗原成分之一，分別含有多個不同T細(xì)胞的表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫。

抗原85復(fù)合體是一組具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白［3］。最早在結(jié)核桿菌和BCG的生長期早期培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn)，在菌體表面也有少量分布。經(jīng)SDS-PAGE和等電聚焦分析可分為3個組分即Ag85A、B、C，大小分別為31、30、30.5（×103），由3個不同的基因編碼。其中有免疫作用的主要為Ag85A和B，Ag85A比Ag85B分泌得多，而 Ag85B在細(xì)菌表面分布較多。范雄林等［4］在小鼠模型上將不同結(jié)核保護(hù)性抗原的 DNA疫苗進(jìn)行了免疫原性及保護(hù)效力的比較，發(fā)現(xiàn)Ag85B是比較理想的候選抗原。另外，在感染結(jié)核或麻風(fēng)菌與卡介苗免疫的小鼠及人體上，Ag85復(fù)合體不僅可以刺激產(chǎn)生體液免疫，而且可激發(fā)較強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫，引起CD8+T細(xì)胞增殖和IL-2、GMCSF及IFN-γ等細(xì)胞因子水平的上升。

EAST6即6KD早期分泌性抗原性蛋白，是從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)濾液（ST-CF）中純化分離出的一種低分子量的分泌性蛋白，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性。EAST6僅存在于結(jié)核桿菌群及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌中，在90％以上的非致病性分枝桿菌中缺乏編碼該蛋白的基因（除勘薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌外），而且在所有BCG中也均缺乏。ESAT6是免疫記憶效應(yīng)性 T細(xì)胞的主要靶抗原之一，可在再次感染的早期，誘導(dǎo)其迅速增值和釋放高水平的 IFN-γ，有效的激活巨噬細(xì)胞來控制結(jié)核病感染［5］。王清民等［6］對融合泛素的Esat6核酸疫苗進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該 DNA疫苗不僅增強(qiáng)了細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且對結(jié)核感染提供了很好保護(hù)。

隨著人們對潛伏感染的認(rèn)識，休眠期結(jié)核桿菌開始受到重視。休眠期結(jié)核桿菌為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境部分基因表達(dá)上調(diào)。Leyten EM等［7］用25種 DosR Regulon編碼的休眠期抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與結(jié)核病人相比，健康的結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)陽性者外周血單個核細(xì)（PBMC）能識別更多的休眠期抗原，并產(chǎn)生更強(qiáng)烈的IFN-γ反應(yīng)。HspX抗原可以被致敏的T細(xì)胞識別，刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ，具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性。

機(jī)體抗TB免疫主要依賴于T細(xì)胞及一些相關(guān)細(xì)胞因子的協(xié)助。對MTB的細(xì)胞胞免疫應(yīng)答是以T細(xì)胞為介導(dǎo)、以巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。有效的抗MTB免疫反應(yīng)包括巨噬細(xì)胞吞噬MTB以及處理與遞呈抗原，T淋巴細(xì)胞對抗原的特異性識別與結(jié)合以及因受刺激而增殖與分化、細(xì)胞因子釋放、巨噬細(xì)胞激活和殺菌等步驟。IL-2通過T淋巴細(xì)胞增長因子和激活巨噬細(xì)胞釋放 IFN-γ消滅MTB，而IFN-γ在機(jī)體的抗MTB感染中發(fā)揮著重要作用，它可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其發(fā)揮殺菌作用。IFN-γ主要由TB患者體內(nèi)的 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生［8］。

本研究將休眠期抗原與生長早期抗原聯(lián)合使用，成功構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒肌肉注射于小鼠，進(jìn)行免疫學(xué)評價。一方面，經(jīng)過特異性抗原的刺激后，隨著免疫時間的延長，免疫小鼠的總IgG抗體水平持續(xù)增加，并于最后一次免疫后2周達(dá)到高峰。并且在第4周和第6周時，DNA疫苗免疫組OD值均高于BCG組，表明融合基因能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)并能保持良好的持久性；另一方面，融合基因免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞誘生的 IFN-γ和 IL-2產(chǎn)量也均高于BCG免疫小鼠，表明該融合基因可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時，誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN-γ的能力通常被用來作為評價候選疫苗是否誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究中ELISPOT檢測結(jié)果表明，應(yīng)用 HspX抗原體外刺激后，融合基因組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ的水平最高，說明該融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

總之，Th1型的細(xì)胞免疫應(yīng)答對控制MTB的感染起著重要的作用，而且IFN-γ和IL-2都是重要的Th1型細(xì)胞因子，并已被證明在抗MTB的治療中具有一定作用［9］。本研究構(gòu)建的 Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗，目的就是希望其誘導(dǎo)的免疫向著有利于控制MTB感染的Th1型的應(yīng)答方向發(fā)展，同時也為今后該疫苗的效力學(xué)評價提供一些理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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