陳陟陽，張俊伶，馬小茗，易微微，陳顯達，石桂英，鞠振宇

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

W IP1（wild-type p53-induced phosphatase）是一種核蛋白，為絲氨酸/蘇氨酸特異蛋白磷酸酶2C型家族（serine/threonine specific protein phosphatase type 2C，PP2C）中的一員，由 PPM1D （protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta）基因編碼，介導(dǎo)眾多DNA損傷應(yīng)急信號通路［1］。W IP1表達非常廣泛，通過 RT-PCR證實在小鼠胚胎和成體幾乎各個臟器組織均有 W IP1 mRNA的表達，包括乳腺、子宮、卵巢、腎上腺、皮膚、肝臟和睪丸等組織均檢測到該基因的表達，特別在睪丸中表達量明顯增高。缺失WIP1的小鼠能夠正常生產(chǎn)，但是卻顯示出一系列的產(chǎn)后缺陷，主要體現(xiàn)在雄性小鼠發(fā)育不全，生殖器官萎縮，W IP1-/-雄性小鼠的睪丸發(fā)育不全，生育力下降及生命期限縮短。缺失 WIP1小鼠表現(xiàn)出對病原體易感性增強［2］。WIP1基因在許多人類癌癥，特別是乳腺癌中過表達，而敲除PPM1D基因的小鼠能夠抵抗乳腺癌的發(fā)生，暗示W(wǎng) IP1可能是一個致癌基因［3，4］。在 APCmin腸癌小鼠模型中，W IP1基因缺失通過促進小腸干細胞的凋亡，調(diào)控小腸干細胞穩(wěn)態(tài)，有效抑制腫瘤生成［5］。在小鼠胸腺發(fā)育中，由于W IP1基因缺失導(dǎo)致 P53的持續(xù)激活，致使T細胞發(fā)育障礙［6］。.在神經(jīng)系統(tǒng)中，WIP1通過P53依賴途徑調(diào)控神經(jīng)干祖細胞的自我更新［7］。此外在對衰老的研究中WIP1基因同樣引起關(guān)注，伴隨著衰老的進行W IP1基因的表達降低，導(dǎo)致胰島 β細胞自我更新及增值能力下降［8］。綜合前期結(jié)果提示，W IP1基因參與細胞增殖、凋亡等眾多信號通路，對DNA損傷修復(fù)［9］、癌癥的發(fā)生、細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控［10］及抗衰老起重要的作用。然而，目前還沒有研究報道過W IP1基因?qū)撬鐱細胞發(fā)育的影響。為了研究W IP1基因是否直接參與調(diào)控成年小鼠B細胞及T細胞的發(fā)育，我們利用基因敲除小鼠及流式細胞術(shù)為工具研究W IP1基因?qū)Τ赡晷∈驜細胞及T細胞發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 PCR方法鑒定W IP1－/－小鼠基因型

小鼠在出生10 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，裂解組織提取基因組DNA，PCR鑒定基因型，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；變性94℃ 30 s，退火61℃30 s，延伸72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。鑒定 引 物 為 Wip1 WT primer1： 5＇-GACAGTCCTGTGCCAAAATGCT-3＇；Wip1 WT primer2：5＇-GGTGACTTGATTGGTGGTGTAGA-3＇；Wip1 KO primer A： 5＇-GCAGGGCTGTTTGTGGTGCT-3＇；Wip1 KO primer B：5＇-GCATGCTCCAGACTGCCTT-3＇，W IP1 -/-產(chǎn)物長度176 bp，WT產(chǎn)物長度236 bp，PCR試劑購自上海生工生物技術(shù)有限公司，中國（圖1）。

1.2 流式細胞術(shù)分析

1.2.1 骨髓單細胞懸液制備：實驗使用成年3月齡129小鼠，頸椎脫臼犧牲小鼠，取雙腿脛骨、股骨用預(yù)冷的PBS沖出骨髓腔的骨髓細胞，吹打成單細胞懸液，過濾、計數(shù)，調(diào)整濃度至1×108cell/m L。本實驗使用小鼠均來自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0007，動物使用許可證號：SYXK（京）2005-0001。

1.2.2 骨髓B細胞及粒細胞染色方案 取10 uL全骨髓細胞懸液置于96孔板一孔中，加入 B220/ PE-cy7（Biolegend）、CD11b/APC-cy7（Biolegend）抗體，冰上避光孵育 30 min，加入 200 uL staining medium（PBS+1％BSA），400 g/m in，離心5 m in，棄上清后用200 uLstaining medium重新懸浮細胞，200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析，每只小鼠收集1 ×105細胞，計算 B220/PE-cy7陽性細胞及CD11b-APC-cy7陽性細胞所占的比例。

1.2.3 骨髓B細胞發(fā)育染色方案 取10 uL全骨髓細胞懸液至于 96孔板一孔中，加入 IgD/FITC （Biolegend）、CD43/Percp-cy5.5（Biolegend）、B220/ PE-cy7（Biolegend）、IgM/APC（Biolegend）抗體，冰上避光孵育30 min，加入200 uL staining medium（PBS +1％BSA），400 g/m in離心 5 m in，棄上清后用200 uL staining medium重新懸浮細胞，200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析，每只小鼠收集1× 105細胞，計算B220+CD43-IgM-IgD-（Pre-B）；B220+CD43-IgM+IgD-（immature-B）；B220+CD43-IgM+IgD+（mature-B）細胞所占的比例。

1.2.4 胸腺單細胞懸液制備 頸椎脫臼犧牲小鼠，完整摘取胸腺，使用兩片載玻片研磨，200目濾網(wǎng)過濾置離心管中，計數(shù)、調(diào)整濃度至 1×108cell/m L。取10 uL細胞懸液置于96孔板一孔中，加入CD8/ FITC、CD45/Percp-cy5.5、CD4/APC-cy7抗體，冰上避光孵育30 min，加入200 uLstaining medium（PBS +1％BSA），400 g/m in離心5 m in，棄上清后用200 uLstaining medium重新懸浮細胞，200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析，每只小鼠收集1×105細胞，計算 CD45陽性細胞、CD8單陽性細胞、CD4/ CD8雙陽細胞、CD4/CD8雙陰性細胞及 CD4單陽性細胞所占的比例。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定結(jié)果及 W IP1基因缺失小鼠形態(tài)差異

圖1 PCR鑒定WIP1基因敲除小鼠的凝膠電泳分析及W IP1缺失小鼠形態(tài)差異圖1A：Marker為DL2000 marker，H20為空白對照，WT為野生型對照，KO為基因敲除對照，HET為雜合對照； 1316/1317/1318/1319為樣品；1B為3月齡W IP1缺失雄性小鼠與同窩野生型對照體型對比Fig.1 PCR genotyping of the W IP1-/-mice and the Morphological alterations in Wip1 nullmales 1A：The marker is the DNA molecular weightmarker；H2O indicates the negative control；WT：wild-type control； KO：WIP1 gene knockout control；HET：heterozygosity control；Lane 1316—1319：stands for DNA samples of W IP1 mice；1B：The smaller animal on the right is W IP1-/-male littermate along with a wild-type male littermate at 3 months of age

基因型鑒定結(jié)果如圖1A所示。W IP1基因在小鼠全身眾多臟器組織中表達，由于W IP1基因在睪丸中表達最為明顯，因此該基因缺失致使雄性小鼠發(fā)育不全，生育力下降，雄性缺失小鼠在3月齡時體型較同窩野生型對照小鼠明顯變小（如圖1B）。有研究報道W IP1缺失的雄性小鼠生命期限明顯縮短，而W IP1+/-雄性小鼠及W IP1-/-雌性小鼠生命期限較野生型差異不明顯。

2.2 骨髓中B細胞比例流式分析

為研究W IP1基因缺失對成年小鼠骨髓B細胞發(fā)育的影響，我們分析了3月齡W IP1-/-小鼠和野生型對照小鼠的骨髓B細胞和M細胞的比例。（如圖2A 2B）。結(jié)果顯示W(wǎng) IP1缺失的小鼠骨髓B細胞比例下降（如圖2C）。而M細胞比例無明顯差異。為了進一步研究B細胞在發(fā)育過程中哪一階段出現(xiàn)問題，我們依據(jù)骨髓B細胞發(fā)育過程中特異性表面標記的表達順序進行了染色（如圖2D 2E 2F 2G），結(jié)果顯示 W IP1基因缺失的骨髓 B細胞各發(fā)育階段比較野生對照均為正常，提示骨髓B細胞比例下降可能是由于Pre-B之前更前體的祖細胞發(fā)育障礙導(dǎo)致。

2.3 胸腺中T細胞比例流式分析

為研究W IP1基因?qū)Τ赡晷∈笮叵侔l(fā)育的影響，我們分析了三月齡W IP1-/-及野生型對照小鼠的胸腺形態(tài)差異（如圖3D），發(fā)現(xiàn)WIP1缺失小鼠的胸腺明顯較野生型對照小，進一步對胸腺白細胞表面標記CD45染色發(fā)現(xiàn)，W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例明顯較野生型低（如圖3A、3B及3C）。

為進一步明確胸腺T細胞在發(fā)育階段哪一步出現(xiàn)問題，我們對胸腺細胞進行CD8及CD4染色。結(jié)果顯示，W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4雙陰性細胞比例明顯升高，而CD8/CD4雙陽性比例降低，由CD8/CD4雙陽性細胞進一步分化的CD8單陽性細胞比例升高，而CD4單陽性細胞變化不大。

3 討論

圖2 骨髓B細胞比例流式分析2A：野生型小鼠骨髓中B細胞、M細胞比例；2B：WIP1敲除小鼠骨髓中B細胞、M細胞比例；2C：WIP1缺失骨髓B細胞比例與野生型對照比較明顯降低；2D-2E：野生型骨髓B細胞發(fā)育流式圖；2F-2G：WIP1缺失小鼠骨髓B細胞發(fā)育流式圖Fig.2 Flow cytometric analysis of the proportion of B cell in bonemarrow2A：The ratio of B cells and M cells in wild-type mice bone marrow；2B：The ratio of B cells and M cells in WIP1-/-mice bonemarrow；2C：Histogram showing the lower percentage of B cells in W IP1-/-mice than WTmice；2D-2E：FACS plots show the development of B cell in WT bone marrow； 2F-2G：FACS plots show the development of B cell in W IP1-/-bone marrow

已有的研究表明W IP1蛋白作為一種磷酸酶，參與眾多細胞信號通路調(diào)控，對DNA損傷修復(fù)、癌癥的發(fā)生、細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及抗衰老起重要的作用。而鮮有研究W IP1在B細胞T細胞發(fā)育過程中是否起到重要作用。我們對W IP1缺失小鼠的骨髓B細胞及胸腺 T細胞進行流式細胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)WIP1缺失導(dǎo)致骨髓 B細胞比例降低，在胸腺中 T細胞發(fā)育障礙。骨髓和胸腺分別是B細胞和T細胞分化發(fā)育成熟的場所。在成熟小鼠的骨髓中，B細胞所占比例為20～30％左右，而W IP1缺失小鼠的骨髓B細胞僅為10％左右，為了弄清楚B細胞在發(fā)育過程的哪一階段遇到障礙，我們進而依據(jù)B細胞發(fā)育階段所表達的特異性表面標記進行染色，流式分析發(fā)現(xiàn)，在Pre-B之后的B細胞發(fā)育各階段細胞比例均正常，從而猜想骨髓中B細胞比例整體降低可能是由于更前體的祖細胞發(fā)育障礙。W IP1缺失小鼠的胸腺中T細胞數(shù)目整體降低，在WIP1敲除小鼠模型中，CD8/CD4雙陰性T細胞比例高于野生型對照小鼠，而CD8/CD4雙陽性細胞比例低于對照組（差異不顯著，但具有統(tǒng)計學(xué)差異），與已有報道一致，而CD8單陽性T細胞比例升高，不同于已有報道的CD8單陽T細胞比例降低，此外CD4單陽T細胞比例變化不明顯而非已有報道的CD4單陽T細胞比例降低。

已有的報道發(fā)現(xiàn)衰老小鼠會產(chǎn)生淋系發(fā)育障礙，同時伴隨著髓系細胞過度增殖［11］，這與人類衰老時免疫能力下降及髓系白血病發(fā)病率升高相吻合。我們的研究表明W IP1基因參與調(diào)控B細胞及T細胞的發(fā)育，W IP1基因缺失導(dǎo)致骨髓B細胞及胸腺T細胞比例下降，影響小鼠免疫系統(tǒng)正常發(fā)育，暗示W(wǎng) IP1基因可能直接參與調(diào)控個體衰老。作為重要的衰老相關(guān)調(diào)控基因，P53、P38等在衰老過程中發(fā)生明顯變化，端?？s短導(dǎo)致的復(fù)制性衰老直接引起P53的高表達；在小鼠胰島β細胞中隨著衰老的進行，WIP1表達逐漸下降，同時 P38表達升高［8］。而W IP1做為P38/P53信號通路的負反饋調(diào)節(jié)基因［1］，W IP1的缺失直接導(dǎo)致 p38/p53的升高，尤其在放射線照射、衰老等應(yīng)激條件下，p38/p53持續(xù)的高表達使受損傷的細胞在修復(fù)之后無法正常的返回細胞周期，從而走向衰老或凋亡?？梢奧 IP1對抗衰老尤其是調(diào)節(jié)免疫衰老具有重要的應(yīng)用前景，然而W IP1的過表達極易導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，因此如何調(diào)控W IP1在衰老進程中的表達仍是限制其臨床應(yīng)用的重要障礙，對W IP1調(diào)控B細胞T細胞的具體分子機制及調(diào)控免疫衰老的機制仍須進一步研究。

圖3 胸腺形態(tài)學(xué)分析注：3A：野生型小鼠胸腺白細胞比例；3B：W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例；3C：W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例較野生型對照組明顯低；3D：野生型小鼠胸腺與W IP1缺失小鼠胸腺形態(tài)比較Fig.3 Morphological alteration about thymus in W IP1-/-nullmiceNote：3A：The ratio of white blood cells in 3 months old wild-type mice thymus；3B：The ratio of white blood cells in 3 months old W IP1deletion mice thymus；3C：Histogram showing the lower percentage of white blood cells in WIP1-/-mice compare with WTmice；3D：Thesize of W IP1-/-mice thymus is much smaller than WT

圖4 胸腺T細胞流式分析4A：WIP1缺失小鼠胸腺CD8單陽性T細胞比例較野生型高；4B：W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4雙陰性T細胞比例較野生型明顯高；4C：WIP1缺失小鼠胸腺CD8CD4雙陽性T細胞比例較野生型低；4D：W IP1缺失小鼠胸腺CD4單陽性T細胞比例與野生型相比無明顯差異；4E：野生型小鼠胸腺T細胞各亞群比例；4F：WIP1缺失小鼠胸腺T細胞亞群比例Fig.4 Flow cytometric analysis of the proportion of T cell in thymus 4A：The ratio of CD8 single positive cells in WIP1 deletion mice is higher than WT；4B： The ratio of CD8/CD4 double negative cells in W IP1 deletion mice is significantly higher than WT；4C：The ratio of CD8/CD4 double positive cells in W IP1 deletion mice is lower than WT；4D：The ratio of CD4 single positive cells do not have different between WIP-/-and WT；4E-4F：FACS plots of different subsets T cells from WT and WIP1-/-m ice thymus

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