耿國(guó)軍 姜杰 杜好信 錢文軒 張義 楊麗華 陳端揚(yáng) 陳雋鵬

（1福建省廈門市中醫(yī)院 廈門 361000；2廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 福建廈門 361009）

黃芪對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的實(shí)驗(yàn)研究*

耿國(guó)軍1姜杰1杜好信1錢文軒1張義1楊麗華2陳端揚(yáng)1陳雋鵬1

（1福建省廈門市中醫(yī)院 廈門 361000；2廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院 福建廈門 361009）

目的：研究分化誘導(dǎo)劑黃芪(Astragalus)在體外對(duì)人肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響。方法：用不同濃度的黃芪分別處理肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞后，鏡下觀察癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；測(cè)定軟瓊脂克隆形成率；MTT(噻唑藍(lán))法測(cè)定生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果：不同濃度黃芪處理后細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率隨黃芪的濃度增加而增加。結(jié)論：黃芪對(duì)肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

黃芪；肺腺癌；SPC-A-1；MTT法；生長(zhǎng)抑制

近年研究表明，黃芪具有提高免疫、增強(qiáng)造血、增強(qiáng)細(xì)胞代謝、清除自由基、抗腫瘤免疫應(yīng)答等作用[1]。為探討黃芪對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，本研究選擇肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，通過一定濃度的黃芪處理肺腺癌細(xì)胞一定時(shí)間后，觀察其對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果，為臨床治療肺癌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪購(gòu)自浙江杭州，配制為20 g/L的無菌溶液備用。流式細(xì)胞儀，為美國(guó)產(chǎn)品。SPC-A-1細(xì)胞株為廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。小牛血清購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)時(shí)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)觀察增殖力 隨機(jī)取5瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A-1細(xì)胞，在其中的4瓶?jī)?nèi)加入不同濃度的黃芪（0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL）。及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)保持藥物濃度不變，連續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞增殖情況。剩余的1瓶正常培養(yǎng)做對(duì)照。

1.3 軟瓊脂克隆形成測(cè)定 參照鄂征[2]報(bào)道的方法，黃芪的濃度分別為 0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL，連續(xù)培養(yǎng)2周，計(jì)算克隆形成率與克隆抑制率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%；克隆抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù))× 100%。

1.4 MTT法 檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。參照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)[3]方法，調(diào)整細(xì)胞濃度至103～104/mL，并使細(xì)胞分散良好；將稀釋的細(xì)胞懸液加到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200 μL。4～5 h細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的黃芪，使不同組的終濃度分別為 0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL，對(duì)照組加等量的培養(yǎng)基，微型震蕩器震蕩后，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)492 nm處測(cè)吸光度值(OD)，計(jì)算抑制率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)以(±S)表示，顯著性比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞24 h顯示出生長(zhǎng)抑制作用，48 h和72 h抑制作用較明顯。0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL黃芪對(duì)SPC-A-1均可抑制細(xì)胞增殖，且隨濃度增加對(duì)SPC-A-1的抑制率也增加，不同濃度組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而且同一濃度黃芪對(duì)SPC-A-1的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，不同時(shí)間組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響 (±S)%

表1 黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響 (±S)%

黃芪(mg/mL) 24h抑制率 48h抑制率 72h抑制率 P值0.25組 2.25±1.16 4.53±1.13 9.63±1.35 ＜0.01 0.50組 4.18±1.13 9.65±1.31 15.38±1.43 ＜0.01 0.75組 7.66±1.27 16.28±1.53 23.26±1.23 ＜0.01 1.00組 12.53±0.36 21.73±1.21 29.65±1.08 ＜0.01 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 不同濃度的黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力的影響 隨黃芪濃度增加，其克隆形成率逐漸下降，克隆抑制率逐漸上升，增殖抑制更加明顯。結(jié)果見表2。

表2 SPC-A-1細(xì)胞克隆形成率及抑制率 (±S)%

表2 SPC-A-1細(xì)胞克隆形成率及抑制率 (±S)%

黃芪(mg/mL) 克隆形成率 克隆抑制率0.00組 16.1±1.68 -0.25組 11.7±1.36 12.3 0.50組 8.56±1.13 53.6 0.75組 5.65±1.22 65.0 1.00組 2.13±0.86 81.6

2.3 不同濃度的黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞作用24 h后吸光度值 吸光度值逐漸下降，其生長(zhǎng)抑制率逐漸增加。結(jié)果見表3。

表3 SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 (±S) %

表3 SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 (±S) %

黃芪(mg/mL) OD 生長(zhǎng)抑制率0.00組 0.313±0.0251 -0.25組 0.295±0.0212 8.5 0.50組 0.275±0.0193 16.1 0.75組 0.246±0.0211 23.0 1.00組 0.223±0.0213 35.6

3 討論

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快、對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。由于其具體發(fā)病機(jī)制仍然不十分清楚，以手術(shù)、化療、放療為主的綜合治療手段仍不盡人意，肺癌的預(yù)后仍較差[4]。中藥作為生物調(diào)節(jié)劑，具有長(zhǎng)效、持久、副作用少的特點(diǎn)，容易為廣大患者所接受，可能會(huì)成為腫瘤治療的一條新途徑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黃芪、氧化黃芪等生物堿成分具有提高免疫、增強(qiáng)造血、增強(qiáng)細(xì)胞代謝、清除自由基、抗腫瘤免疫應(yīng)答等多方面生物活性而備受關(guān)注[5～6]。肺癌的高侵襲及轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性多年來一直困擾著臨床治療工作，尋找新的治療方法和有效抗癌藥物具有相當(dāng)重要的意義。

近年來，隨著惡性腫瘤的誘導(dǎo)分化療法的日益興起，黃芪作為一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的誘導(dǎo)分化劑引起研究者越來越多的關(guān)注和興趣。細(xì)胞持續(xù)分裂和不斷增殖是腫瘤區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要特征，因此，觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性的抑制作用是篩選誘導(dǎo)分化劑的基本指標(biāo)。在本研究中，我們通過較長(zhǎng)時(shí)間的觀察SPC-A-1細(xì)胞的擴(kuò)增傳代發(fā)現(xiàn)：在黃芪的作用下，SPC-A-1細(xì)胞增殖減慢，隨黃芪濃度增加，其增殖抑制更加明顯，最后停止生長(zhǎng)。雖然其中可能發(fā)生細(xì)胞的凋亡或死亡，但細(xì)胞增殖抑制是肯定的。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力及檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的有效方法[6]，為進(jìn)一步證實(shí)黃芪對(duì)SPC-A-1細(xì)胞的抑制作用，我們應(yīng)用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法。結(jié)果表明，除0.25 mg/mL組外，其余各組與對(duì)照組相比，均有顯著性差異（P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加，其生長(zhǎng)抑制率及克隆抑制率明顯增高。這與其他的研究報(bào)道[7～9]一致。

綜上結(jié)果分析，一定濃度的黃芪能有效地抑制SPC-A-1細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并且隨濃度的增加其抑制作用明顯增加。其作用機(jī)制可能與黃芪調(diào)控SPC-A-1細(xì)胞的凋亡有關(guān)，不是單純的細(xì)胞毒性壞死[10]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是基因芯片和蛋白芯片技術(shù)的發(fā)展,必將對(duì)黃芪類抗腫瘤機(jī)制[12]的研究起到很大的推動(dòng)作用，而針對(duì)這些機(jī)制的研究定會(huì)開發(fā)出新型的與黃芪類抗腫瘤作用同一分子靶點(diǎn)的藥物，這將為腫瘤的治療開辟一條新途徑。

[1]許杜娟,吳強(qiáng),楊雁,等.黃芪總苷的抑瘤作用及其作用機(jī)制[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(7):823-826

[2]鄂征.組織培養(yǎng)與分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)[M].北京：北京出版社,1996.312

[3]司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)[M].西安：興國(guó)圖書出版公司,2001.186

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[5]楊雁,陳敏珠.黃芪總苷對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡及wtp53基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2001,17(4):447-451

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Objective:To study the activity of the growth suppression effects with Astragalus on SPC-A-1 human lung adenocarcinoma cel1.Methods:Different concentrations of Astragalus were used in the culture of SPC-A-1 cells.Determination of clone forming ability on soft agar and growth suppression effects with Astragalus were measured by a tetrazolium-based volorimetric assay (MTT assay).Results:Proliferation of SPC-A-1 cells was inhibited effectively after being treated by different concentrations of Astragalus, the rate of growth suppression was increasing with increased concentration of Astragalus.Conclusion:Astragalus have the significant effect on inhibiting on SPC-A-1 human lung adenocarcinoma cel1.

Astragalus;Lung adenocarcinoma cel1;SPC-A-1;Thiazolyl blue;Growth suppression

R 285.5

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2011.01.002

*福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目：閩科計(jì)[2008]59號(hào)文

2010-09-06）