劉 蓉，趙 瑾，陳國(guó)勤，張新鳳，陸潔萍，李洪濤

（1.呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州醫(yī)學(xué)院）；2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120）

通光散又名扁藤，為云南地方草藥，性味苦寒，具有清熱解毒，止咳平喘的作用［1-3］。但目前還沒(méi)有單味中藥通光散治療哮喘的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。為開(kāi)發(fā)我國(guó)特有的中草藥資源，我們?cè)诮⑿∈笙Ｐ偷幕A(chǔ)上，利用Buxco小動(dòng)物肺功能儀等先進(jìn)的儀器設(shè)備和方法，確定其對(duì)哮喘動(dòng)物模型氣道高反應(yīng)和氣道炎癥的影響，探討通光散治療哮喘的可能機(jī)制，為通光散的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

雞卵白蛋白OVA（Grade V，美國(guó)Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國(guó)Sigma公司），低溫離心機(jī)（Bec km an，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡及Nikon數(shù)碼攝影一體化系統(tǒng)（Nikon，日本），小動(dòng)物肺功能儀（Buxco，美國(guó)）。

1.2 中藥

通光散，購(gòu)自昆明福林堂中藥飲片有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)：滇Y20050050）。通光散湯：通光散120 g，加水1 000 m L，文火煎至200 m L，每毫升含生藥量約0.6 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立

35只SPF級(jí)6周齡雌性BALB/c小鼠，體重16～19 g，合格證號(hào)：0082361，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠分籠飼養(yǎng)于廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室屏障環(huán)境（許可證號(hào)：SYXK（粵） 2008-0093），動(dòng)物自由進(jìn)食顆粒飼料和純凈水。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NS，n=10）、模型組（Asthma，n=13）和藥物實(shí)驗(yàn)組（Experiment，n= 12）。以O(shè)VA首次致敏為0 d，模型組和藥物組分別于第0、7、14天每只小鼠分別腹腔注射致敏液OVA200μL（0.04％OVA-NS 50μL與150μL液態(tài)鋁混合）；對(duì)照組腹腔注射200μL生理鹽水（NS）。第15天后，藥物組每天灌胃給予通光散湯0.72 m L （20 g/kg體重，約合兒童每天用量的10～15倍），對(duì)照組和模型組則以與藥物組等量的生理鹽水（NS）灌胃。于第28、29、30天，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，模型組和藥物組每只小鼠以O(shè)VA（0.4％溶液50μL）滴鼻，利用小鼠自然呼吸將液滴吸入氣道；對(duì)照組用等量的NS滴鼻，1次/d。

1.4 氣道反應(yīng)性的測(cè)定

末次激發(fā)48 h后，用小動(dòng)物肺功能儀無(wú)創(chuàng)法測(cè)定小鼠的氣道阻力［4，5］，結(jié)果以增強(qiáng)的呼吸間歇（enhanced pause，Penh）表示。首先記錄小鼠氣道阻力的基礎(chǔ)值（Baseline）1 min，隨后測(cè)定30μL生理鹽水（NS）和30μL倍增濃度的乙酰甲膽堿（Mch）霧化激發(fā)小鼠氣道后氣道阻力的變化，每次霧化1 m in，記錄3 min。Mch激發(fā)梯度濃度分別為3.12、6.25、12.5、25、50和100 mg/m L。以NS的Penh值為標(biāo)準(zhǔn)值，將各個(gè)濃度Mch的Penh與標(biāo)準(zhǔn)值的比值（Penh/NS）作為氣道反應(yīng)性統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。

1.5 肺泡灌洗液（BALF）收集及細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠麻醉處死后仰臥位固定，行氣管插管手術(shù)，以0.8 m L PBS緩沖液灌洗肺泡3次，回收率在80％以上。BALF細(xì)胞沉淀作涂片，10％中性甲醛溶液固定后HE染色，連續(xù)計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞分類，計(jì)算各細(xì)胞的百分比構(gòu)成。

1.6 肺組織病理學(xué)觀察

將左肺上葉分離，10％中性甲醛溶液固定24 h以上，石蠟包埋，切片，HE染色和PAS染色后行肺組織病理觀察。HE染色切片參考Henderson的方法按以下標(biāo)準(zhǔn)半定量評(píng)定支氣管/血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度［6，7］：-（0分）：支氣管/血管周圍幾乎無(wú)炎癥細(xì)胞；+（1分）：支氣管/血管周圍散在少許炎癥細(xì)胞；++（2分）：支氣管/血管周圍較多分布不均的炎癥細(xì)胞但未聚集成團(tuán)；+++（3分）：支氣管/血管周圍大量炎癥細(xì)胞，分布較均勻，但少見(jiàn)聚集成團(tuán)；++++（4分）：支氣管/血管周圍大量炎癥細(xì)胞聚集成團(tuán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法（LSD），當(dāng)方差不齊時(shí)用Tamhane＇s T2法。在造模過(guò)程中死亡及感染的動(dòng)物不列入統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

OVA激發(fā)前，即28 d之前，三組小鼠狀態(tài)表現(xiàn)正常，體重增加。在第28天用OVA激發(fā)后，模型組和藥物組動(dòng)物毛色失去光澤，蓬松，從小鼠體重有明顯下降（圖1）。對(duì)照組小鼠激發(fā)過(guò)程中未出現(xiàn)明顯的上述表現(xiàn)。模型組和藥物組在OVA激發(fā)過(guò)程中分別有2只和3只小鼠死亡，主要原因可能是麻醉過(guò)深、滴鼻后導(dǎo)致窒息死亡。

圖1 小鼠體重變化曲線Fig.1 Body weight changing curve of the mice

2.2 小鼠氣道阻力（Penh/NS）的變化

小鼠氣道阻力的變化見(jiàn)表1。

2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類的變化

模型組BALF中細(xì)胞總數(shù)和Eos（％）較對(duì)照組明顯增加，模型組中Eos（％）接近70％（P＜0.01）（表2）。

2.4 小鼠肺組織病理變化

小鼠肺組織病理變化見(jiàn)圖2（見(jiàn)彩插4）.

3 討論

支氣管哮喘（Asthma，以下簡(jiǎn)稱哮喘），又稱氣道變異性炎癥（AAl），是最常見(jiàn)的以氣道高反應(yīng)性和氣道通氣障礙為特征的慢性呼吸道疾病，被世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為四大頑癥之一［7］。目前哮喘的防治均采用局部療法，應(yīng)用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的抗炎藥物。但是由于激素的副作用，使其在應(yīng)用上受到限制，特別對(duì)于兒童病人。通光散（Marsdenia tenacissima）是蘿藦科牛奶菜屬植物［1］，廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，包括我國(guó)的云南、貴州等地。其活性成分不僅具有抗癌的作用，而且具有平喘作用［10］。據(jù)《云南抗癌中草藥》記載［2］：通光散別名烏骨藤，具有味苦，清熱、解毒、止咳平喘、散結(jié)止痛的作用?！稄V西藥用植物名錄》通光藤莖止咳，祛痰，平喘，用于慢性支氣管炎［3］。通光散價(jià)格便宜，購(gòu)買也很方便。長(zhǎng)期以來(lái)作為主藥用于哮喘病人的治療［9］。但是缺少臨床前的基礎(chǔ)研究特別是藥效學(xué)的研究。本實(shí)驗(yàn)首先建立小鼠哮喘模型，利用Buxco小動(dòng)物肺功能儀對(duì)哮喘動(dòng)物模型氣道高反應(yīng)測(cè)定，同時(shí)結(jié)合病例分析，觀察其對(duì)小鼠模型氣道炎癥的影響。結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，哮喘模型動(dòng)物具備氣道高反應(yīng)性；小鼠哮喘模型BALF中白細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，Eos的比例接近70％，支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道分泌大量黏液，說(shuō)明哮喘模型的建立是成功的。雖然BALF總數(shù)與其他報(bào)道略有不同，原因可能與方法不同有關(guān)，但不影響對(duì)結(jié)果的判斷。實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與模型組有明顯差異，與對(duì)照組接近，說(shuō)明TGS對(duì)于抑制哮喘氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥的效果是十分明顯的。

表1 小鼠經(jīng)乙酰甲膽堿（Mch）激發(fā)后氣道阻力（Penh/NS）的變化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

表1 小鼠經(jīng)乙酰甲膽堿（Mch）激發(fā)后氣道阻力（Penh/NS）的變化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

＊P＜0.05 vs.asthma group.

組別Group乙酰甲膽堿Mch（mg/mL） 3.12 6.25 12.5 25 50 100正常對(duì)照組Normal 1.12±0.12 1.35±0.22* 1.73±0.31* 3.45±0.61* 4.57±0.45* 5.23±1.21*哮喘模型組Asthma 1.31±0.31 2.06±0.63 3.24±0.7 4.69±0.27 6.58±0.79 8.53±1.1藥物治療組Experiment 1.29±0.23 1.46±0.31* 2.18±0.44* 3.32±0.49* 4.83±0.66* 5.57±0.66*

表2 三組BALF細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類的變化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

表2 三組BALF細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類的變化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

P＜0.05 vs.asthma group.

組別Groups BALF細(xì)胞總數(shù)The total cells of BALF嗜酸粒細(xì)胞Eos單核細(xì)胞Mac淋巴細(xì)胞Lym粒細(xì)胞Neu （×104/m L）（％）（％）（％）（％）正常對(duì)照組NS 3.21±2.58* 0.08±0.15* 70.88±18.82* 10.52±12.79* 17.85±19.46*哮喘模型組Asthma 14.59±8.60 69.22±7.87 24.00±7.91 2.67±1.48 4.11±1.87藥物治療組Experiment 5.32±2.02* 2.12±0.18* 61.81±20.52* 15.98±12.67* 20.09±19.85*＊

嗜酸性粒細(xì)胞是支氣管哮喘發(fā)病的主要效應(yīng)細(xì)胞，能釋放炎癥介質(zhì)及炎癥蛋白顆粒，引起氣道高反應(yīng)性及炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察到哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比明顯升高，肺病理切片也可見(jiàn)細(xì)支氣管壁黏膜水腫、增厚，肺泡及細(xì)支氣管中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，嗜酸性粒細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，引起氣道上皮損傷和氣道高反應(yīng)性。其釋放的氧化產(chǎn)物可破壞肺周圍組織的完整性。嗜酸性粒細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)又可促進(jìn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞本身的募集作用［8］，中藥TGS可明顯減少嗜酸性粒細(xì)胞的滲出，本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，給藥TGS后，BALF中EOS數(shù)目可明顯減少，肺組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)肺部炎癥減輕，表明TGS具有抗氣道炎癥作用，由此可推斷TGS平喘機(jī)制之一可能與抑制炎癥細(xì)胞的滲出有關(guān)。

本研究建立的小鼠哮喘模型，符合哮喘發(fā)作期可逆性氣流受限及氣道高反應(yīng)典型特征。實(shí)驗(yàn)觀察到通光散湯可顯著抑制哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性，改善肺功能，具有抗哮喘作用。

（致謝：感謝張秀蘭醫(yī)生的支持和幫助!）

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