趙璽龍，楊舉倫，宋蜀伶，徐文漭，潘鑫艷，黎貴蕓，李 鋒

（1.解放軍昆明總醫(yī)院病理科 實驗動物病理檢測中心，昆明 650032； 2.云南省靈長類實驗動物有限公司，昆明 650216）

實驗動物的質(zhì)量控制是保證實驗結(jié)果精確的前提，目前主要的烈性傳染性致病因素已經(jīng)得到了有效監(jiān)控，但是按現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)檢測合格、外觀健康的恒河猴，也可能存在一定程度的由自然發(fā)病因素導(dǎo)致的病理學(xué)病變，并影響到實驗動物的飼養(yǎng)和實驗結(jié)果的評析。國外學(xué)者對實驗猴等大型實驗動物的自發(fā)疾病和老化性疾病的研究較為重視［1，2］。國內(nèi)對實驗動物自發(fā)病變的研究還很不足，有關(guān)實驗動物的病理檢測資料尚未建立，研究人工飼養(yǎng)條件下實驗動物臟器病理變化，有助于我們對實驗動物的自發(fā)病狀況有更科學(xué)的認(rèn)識，對于實驗動物質(zhì)量控制和實驗動物應(yīng)用具有重要意義。

恒河猴是非常重要和珍貴的實驗動物，在人類學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等研究中具有重要作用［3-6］。腸道是是實驗動物最易發(fā)生病變的器官之一，也是重要的造模器官和藥物實驗靶器官，既往文獻報道腸道病變是實驗猴的主要致死原因之一［7，8］。本課題選取了155只無人為處理干擾因素自然死亡的實驗恒河猴，對腸道做了病理剖檢和顯微鏡下組織學(xué)觀察，以期了解自然死亡實驗恒河猴腸道病理改變特點，豐富完善實驗猴自發(fā)病研究資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

恒河猴腸道組織樣品取自云南省地區(qū)1998年～2008年有資料記錄的155只自然死亡實驗猴尸檢材料，年齡分布2～20歲，分為幼年組（＜4歲）59只、成年組（4～13歲）35只和老年組（＜13歲）61只，雌性91只，雄性64只。均系在飼養(yǎng)期間非人為因素死亡。對照組為成年健康實驗猴腸道組織學(xué)切片，取自本課題組前期部分實驗材料。本實驗所用實驗猴來源于云南省靈長類實驗動物有限公司【SYXK（滇）2009-0003】。

1.2 解剖固定

實驗猴死亡2 h以內(nèi)解剖，將腸管沿腸系膜剪開，置放于廣口玻璃容器中用10％甲醛液固定，黏膜面朝向容器液面，并在表面覆蓋紗布，固定液量約為3 000 mL，固定時間不小于72 h。

1.3 取材

觀察腸管漿膜面、黏膜面色澤、質(zhì)地。檢查是否有腫物、實變、壞死、出血等病變，常規(guī)病理方法取材，取材切面與腸腔長軸平行，組織塊長約為2.5 cm，寬度約為0.3 cm，厚度為腸壁全層厚度，組織塊平置于包埋筐，包埋面向下。

1.4 脫水制片

Shandon Excelsior ES脫水機脫水；常規(guī)石蠟包埋；Microm HM325切片機切片（厚度設(shè)定為2μm）； Leica auto stainer XL染色機HE染色、封片。

1.5 組織學(xué)觀察

在Olympus BX41光學(xué)顯微鏡下，按4倍、10倍、40倍順序觀察。2名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師顯微鏡下分別觀察并記錄病變。所描述病變不同時請第三方上級醫(yī)師會診確定。

2 結(jié)果

2.1 實驗猴腸道病變檢出率

155例恒河猴中58例發(fā)現(xiàn)腸道病變，檢出率為37.41％，其中幼年組發(fā)生率為28.81％，成年組34.29％，老年組47.54％。隨年齡增長，腸道病變率增加，見表1。

表1 實驗猴腸道病變例數(shù)（n）及發(fā)生率（％）Tab.1 The distribution of intestinal lesions in the rhesusmonkeys（n，％），P=0.05

2.2 實驗猴腸道主要病理改變特點

本組實驗猴腸道主要有8種病理改變：

（1）慢性炎：黏膜層見多少不等的慢性炎細(xì)胞浸潤，主要是淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、組織細(xì)胞等（圖1A）；（2）急性炎：黏膜層多少不等的以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，有時在上皮隱窩內(nèi)有小膿腫形成，常伴有上皮細(xì)胞變性壞死、糜爛、潰瘍和出血（圖1B）；（3）水腫：黏膜水腫，間質(zhì)稀疏、淡染，固有層腺體間距離增大，小腸黏膜水腫時腸絨毛變粗變短，常伴隨有血管擴張充血；（4）上皮細(xì)胞壞死：黏膜上皮細(xì)胞碎裂，溶解，鏡下多呈紅染的無定形物，黏膜上皮可出現(xiàn)多少不一缺失，常伴有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤；（5）糜爛：黏膜表面上皮細(xì)胞變性壞死，并伴有較多量的中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，黏膜表面可見急性纖維素性滲出物，間質(zhì)常常水腫伴充血、出血（圖1C）；（6）潰瘍：典型的潰瘍改變有四層結(jié)構(gòu)，表面為以中性粒細(xì)胞為主的炎性滲出；其下為壞死物（有時不可見），壞死層下為肉芽組織，最下層為瘢痕層。潰瘍旁黏膜一般呈慢性炎伴急性炎，上皮常有修復(fù)性增生，有時細(xì)胞有不典型性（圖1D）；（7）穿孔：潰瘍嚴(yán)重時可深達漿膜，穿透腸壁，顯微鏡下可見潰瘍累及全層達漿膜，周圍的組織可見纖維素性壞死滲出物，外圍為肉芽組織。漿膜外腸系膜可見急性炎細(xì)胞浸潤伴壞死，慢性包裹后可呈肉芽腫性炎改變（圖1E、1F）；（8）寄生蟲：蟲體常位于腸黏膜下、漿膜外，蟲體周圍纖維組織程度不一的增生，常伴有肉芽腫性炎，有時可見鈣化。蟲卵一般在漿膜層，數(shù)量較多的蟲卵聚集成結(jié)節(jié)，被纖維組織包裹，可伴有鈣化（圖1G、1H）（圖1見彩插6）。

3 討論

2.3 實驗猴不同年齡組腸道病變檢出結(jié)果及分析

圖2為實驗猴不同年齡組腸病變類型分布基本相同，病變幼年組檢出8種、成年組7種，老年組8種。各組間病變發(fā)生率差異不大，以老年組最高。各組均以急性炎發(fā)病率最高：老年組為21.31％，成年組17.14％，幼年組18.64％；急性腸炎引起的相關(guān)病變各組病變率基本接近，黏膜水腫和出血病變檢出率成年組略低與其他兩組。不同年齡組間卡方檢驗結(jié)果未顯示不同年齡組間差異有顯著性（表 2）。

腸道是最重要的消化器官，胃腸道與外界相通，受飲食、環(huán)境等外源性因素影響較大，較易出現(xiàn)病變。本組資料觀察到實驗猴腸道病變率較高（37.40％），主要病理改變有慢性腸炎、急性腸炎、黏膜水腫、出血、糜爛、潰瘍、穿孔、寄生蟲（表2、圖1）。死亡實驗猴腸道病理損害嚴(yán)重并有致死性，既往關(guān)于實驗猴腸道病理改變的專題研究罕見報道，程樹軍等［9］對65只實驗恒河猴消化系統(tǒng)進行了病理組織學(xué)觀察，將腸道病變分別按炎細(xì)胞浸潤、黏膜上皮變性、黏膜充血、色素細(xì)胞沉積、腸膿腫5種病變進行研究分析。本實驗更強調(diào)疾病的探討，因為實際情況中實驗猴消化道與外界相通，正常狀態(tài)下也存在一定程度的病理變化，如散在的漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，局部的充血、變性等，這些病理改變較輕微，病變可逆，不影響腸道正常生理功能對于絕大多數(shù)的動物實驗不影響對其實驗結(jié)果的合理評價，我們認(rèn)為可界定為“正常動物組織的改變”。本實驗以疾病為索引探討腸道病理學(xué)改變，以更科學(xué)地評價實驗猴腸道自發(fā)病變。實驗猴腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu)與人基本相同［10］，由內(nèi)向外分為黏膜、黏膜下層、肌層和外膜。腸道病變與人病變相似，對實驗猴腸道疾病分類和病理改變判別主要依據(jù)《診斷病理學(xué)》［11］。

圖2 腸道病變不同年齡組分布柱形圖Fig.2 Histogram of different intestinal lesions in the different age groups

表2 各種腸道病變在各年齡組的檢出例數(shù)（n）及發(fā)生率（％） Tab.2 The number and rate of intestinal lesions in different age groups（n，％）

消化道是開放性的系統(tǒng)，本身易受食物、環(huán)境等因子的影響，也與機體的消化吸收功能密切相關(guān)。既往有文獻報道［7，8］實驗猴尸檢中腸炎病例最多。本組資料顯示死亡實驗猴腸道病變不同年齡組腸病變類型分布基本相同，病變發(fā)生率老年組最高，腸道病變率隨年齡增長而增高，以慢性病變增高為主，急性病變各組間差異不大。各組均以急性腸炎發(fā)病率最高，組間卡方檢驗顯示不同年齡組腸道病變無明顯差異。腸道病變最重要的為急性腸炎，急性腸炎表現(xiàn)為黏膜多少不一的以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，死亡實驗猴急性腸炎病理損害常常較重，常伴有黏膜水腫、充血出血，嚴(yán)重時黏膜上皮壞死脫落，形成糜爛或潰瘍，病情嚴(yán)重的可見穿孔。急性腸炎在各組實驗猴的發(fā)生率均較高：幼年猴組為18.64％，成年組17.14％，老年組21.31％。與我們在呼吸系統(tǒng)觀察結(jié)果比較，本組資料觀察結(jié)果急性腸炎發(fā)病率為20.00％，高于呼吸系統(tǒng)支氣管肺炎的發(fā)病率（18.71％），是呼吸、消化兩大系統(tǒng)發(fā)病率最高的疾病之一，也是病理改變程度最嚴(yán)重，導(dǎo)致實驗猴死亡的主要原因之一。急性腸炎最常見的病因為由志賀氏桿菌和沙門氏桿菌感染，患病猴一般表現(xiàn)為［12］腹瀉、膿血便，嚴(yán)重時引起脫水、衰竭和中毒。大體檢查主要改變?yōu)槟c壁水腫、增厚、腸黏膜糜爛、潰瘍，顯微鏡下主要表現(xiàn)為急性炎和充血、糜爛，病理檢查對腸道病變診斷有重要提示意義，如沙門菌病、結(jié)核桿菌病顯微鏡下分別表現(xiàn)為傷寒肉芽腫和結(jié)核肉芽腫，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病病理檢查可見縱行潰瘍、急性炎及化膿性肉芽腫等［13］，需要指出的是由于腸道疾病病理學(xué)變化有時缺乏特異性，對病變的評析判讀有一定的局限性，對實驗猴腸道病變的檢測和評判應(yīng)注意采集實驗室病原學(xué)檢查資料。其他需要注意的病變有潰瘍和寄生蟲，潰瘍不僅嚴(yán)重影響患病猴的進食消化，還會伴發(fā)消化道出血、穿孔，導(dǎo)致患病猴死亡。通過實驗動物工作者不懈的努力和實驗猴飼養(yǎng)環(huán)境的改善和科學(xué)化質(zhì)控，實驗猴寄生蟲感染率已經(jīng)得到有效控制，本組實驗猴胃腸道寄生蟲發(fā)病率為4.52％，與既往研究報道［14，15］結(jié)果相比顯著降低。

隨著實驗猴飼養(yǎng)基地條件的不斷改善和飼養(yǎng)水平的提高，實驗猴死于消化道病變的比例已有下降［16］，尤其是寄生蟲感染率已經(jīng)明顯下降，但腸道病變?nèi)匀皇菍嶒灪镒钪饕闹滤佬栽蛑?。消化道病變的人工預(yù)防、干預(yù)的范圍較大，在實驗猴飼養(yǎng)過程中，應(yīng)繼續(xù)加大環(huán)境管理、飼養(yǎng)管理，避免內(nèi)部感染，患病猴及時隔離治療。有研究報道實驗猴腸炎治療糞便轉(zhuǎn)好后，行病理檢查仍見到腸黏膜充血水腫現(xiàn)象［16］，這提示實驗猴繁育過程中，不能僅以糞便的好壞作為腸炎治愈的判斷標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)適當(dāng)考慮其達到痊愈的恢復(fù)過程中的治療保護。

［1］Ito T，Chatani F，Sasaki S，et al.Spontaneous lesions in cynomolgusmonkeys used in toxicity studies［J］.Exp Anim，1992，41：455-469.

［2］Morishima H，Nonoyama T，Sasaki T，et a1.Spontaneous lesions in beagle dogs used in toxicity studies［J］.Jikken Dobutsu，1990，39：239-248.

［3］KlumPP SA，Anderson DC，Novembre FJ，et al.Animal model for pediatric AIDS：Pathology in infant rhesus monkeys infected with SIVSMM throughmaternal transmission［J］.Med primatol，1992，21：124-129.

［4］WorldHealth Organization.Draft recommendations for poliomyelitis vaccine［J］.Expert committee biological standardization，1999，7：16-19.

［5］R.T.W illiams.SP ecies Variations in the pathways of drug metabolism［J］.Environmental Health P ersP ectives，1978，（22）：133-138.

［6］Davidson DE Jr，Johnsen DO，Tanticharoenyos P，et al.Evaluating new antimalarial drugs against trophozoite induced plasmodium cynomolgi malaria in rhesus monkeys［J］.Am J TroP Med Hyg，1976 25（1）：26-33.

［7］羅其勝，王慶玲，李松珍，等.獼猴疾病尸檢材料的分析［J］.中國獸醫(yī)科技，1989，2：42.

［8］羅其勝，王慶玲，李松珍，等.獼猴消化系統(tǒng)疾病的病理學(xué)分析［J］.上海實驗動物科學(xué)，1990，10：110-112.

［9］程樹軍，黃韌，秦瑤，等.獼猴消化系統(tǒng)自發(fā)病變的組織病理學(xué)觀察［J］.上海實驗動物科學(xué)，2003，23（3）：131-134.

［10］楊舉倫，李濤，趙璽龍，等.實驗猴正常組織學(xué)圖譜［M］.云南：云南科學(xué)技術(shù)出版社.2007：135-144.

［11］劉彤華主編.診斷病理學(xué)（第2版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社.2006：58-77.

［12］賁昆龍，著.實驗獼猴的疾病防治［M］.北京：科學(xué)出版社.1978：7-28.

［13］趙璽龍，李鋒，趙萬秋，等.實驗猴主要細(xì)菌性感染疾病的病理特點分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（2）：75-77.

［14］羅其勝，秦田生，李松珍，等.獼猴體內(nèi)寄生蟲和組織病理學(xué)分析［J］.動物學(xué)雜志，1884，4：4-6.

［15］王淑芬，達文亮，趙清海.恒河猴腸道寄生蟲的調(diào)查研究［J］.天津畜牧獸醫(yī)，1995，12（2）：21-24.

［16］代解杰，謝晉，和占龍.人工飼養(yǎng)條件下恒河猴病理分析的研究［J］.中國實驗動物學(xué)雜志，1999，9（1）：34-37.