錢(qián) 莉,潘興元,龔衛(wèi)娟,季明春

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州,225001)

許多細(xì)胞因子如 IL-1、IL-15、TGF-β、TNF-α、M-CSF等,除了經(jīng)典的可溶性形式以外,還以膜結(jié)合形式存在[1]。細(xì)胞因子的這兩種形式存在著功能上的差異。如膜結(jié)合型的IL-15比其可溶狀態(tài)具有更強(qiáng)的刺激NK細(xì)胞擴(kuò)增的作用[2-3];膜結(jié)合型TNF-α通過(guò)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的直接接觸而發(fā)揮局部殺瘤效應(yīng),故毒副反應(yīng)比可溶性TNF-α小,而且其殺瘤譜比可溶性 TNF-α廣。目前主要通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建膜型細(xì)胞因子:將細(xì)胞因子的成熟肽基因與跨膜分子的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)編碼基因連接,構(gòu)成嵌合基因,使細(xì)胞因子由可溶性表達(dá)變?yōu)槟ば捅磉_(dá)[4]。常用的跨膜分子有 TNF、CD4和CD8分子等[5]。本研究主要運(yùn)用基因工程的方法獲得CD8分子α鏈的重組表達(dá)載體,并將其表達(dá)在SP2/0細(xì)胞的表面,為進(jìn)一步構(gòu)建膜型細(xì)胞因子奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TRizol購(gòu)自美國(guó)Gibco BRL公司;細(xì)胞總RNA試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自上海飛捷生物公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;dNTP購(gòu)自MBI Fermentas;PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自日本 TaKaRa公司;抗CD8α磁珠購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec;FITC和 PE標(biāo)記的抗CD8α單抗以及同型對(duì)照抗體均購(gòu)自美國(guó)BD Phar ming公司。

1.2 磁珠分選CD8α+T細(xì)胞及純度檢測(cè)

無(wú)菌分離獲取C57BL/6J小鼠的脾臟,用無(wú)菌針芯將脾臟磨碎,經(jīng)孔徑為0.037 mm鋼網(wǎng)濾過(guò)并收集單細(xì)胞,Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞,PBS洗滌2遍,用磁珠標(biāo)記的抗小鼠CD8α單抗4℃標(biāo)記15 min,PBS洗滌1遍,經(jīng)磁式分選儀陽(yáng)性分選CD8α+T細(xì)胞。取 2×105經(jīng)磁珠分選的CD8α+T細(xì)胞,離心壓積,去上清。混勻細(xì)胞,大鼠血清封閉,4℃孵育10 min。加入PE標(biāo)記的抗CD8α單抗,4 ℃孵育 15 min。PBS洗1次,流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用CellQuest軟件分析。

1.3 重組pVITRO/CD8α表達(dá)載體的構(gòu)建

取磁珠分選得到的CD8α+T細(xì)胞,用trizol常規(guī)抽提RNA,以O(shè)ligo(dT)n為引物,反轉(zhuǎn)錄mRNA生成cDNA。用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CD8α的引物,兩端分別加BamH I和Sal I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。上游引物序列為 5′-TCAGGATCCATGGCCTCACCGT TGACCC-3′,下游引物序列為 5′-ACTGTCGACT TACACAATTTTCTCTGAAGGTCT-3′。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?98℃預(yù)變性2 min,98℃變性10 s,68℃退火和延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),最后再延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后,用BamH I、Sal I雙酶切,與經(jīng)同樣酶切處理的pVITRO載體按10∶1連接、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株中,次日挑取菌落抽提質(zhì)粒酶切鑒定正確后送公司測(cè)序。

1.4 pVIT RO/CD8α轉(zhuǎn)染 SP2/0 細(xì)胞

無(wú)菌條件下抽提pVIT RO/CD8α質(zhì)粒。按照脂質(zhì)體試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,具體過(guò)程為:取對(duì)數(shù)期的SP2/0細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)液洗2次,于24孔板中每孔加入5×105個(gè)細(xì)胞,每孔500 μ L體系,共10孔。取8 μ g的質(zhì)粒用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋至總量500 μ L,取20 μ L的脂質(zhì)體用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋至總量500 μ L,兩者混合,微混勻,室溫孵育20 min,每孔加入100 μ L的復(fù)合物。37℃6 h后更換含10%小牛血清的RMI 1640培養(yǎng)基,48 h后棄上清,收集細(xì)胞用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8α的表達(dá)率

取pVITRO/CD8α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SP2/0細(xì)胞2×105,PBS洗滌。用PE標(biāo)記的CD8α單抗4℃孵育15 min,PBS洗1次后,用流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)檢測(cè)。

1.6 共聚焦顯微鏡檢測(cè)CD8α在SP2/0細(xì)胞中的定位

取pVITRO/CD8α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SP2/0細(xì)胞2×105,用FITC標(biāo)記的CD8α單抗4℃孵育15 min,PBS洗滌,4%的多聚甲醛室溫固定20 min,用PBS洗 1遍,然后加 200 μ L的PBS 重懸細(xì)胞,按1∶1 000加Honest室溫5 min染核,再用PBS洗1遍,最后用10 μ L的PBS重懸細(xì)胞,點(diǎn)在玻片上,自然晾干,用封片劑(90%甘油,10%PBS,pH8.0)封片后置激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)磁珠分選的CD8α+T細(xì)胞的純度

經(jīng)磁珠分選的CD8α+T細(xì)胞用PE-CD8α單抗標(biāo)記后,顯示CD8α+T細(xì)胞的純度為97%(圖1),可用于下步提取總RNA。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)磁珠分選的CD8α+T細(xì)胞純度

2.2 獲得CD8αcDNA 的PCR產(chǎn)物

經(jīng)過(guò)CD8α+T細(xì)胞總 RNA的抽提,逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng),獲得了CD8αcDNA的產(chǎn)物,片段大小為750 bp左右,與理論設(shè)計(jì)的核苷酸片段大小相符(圖2)。

圖2 CD8αcDNA 的PCR產(chǎn)物

2.3 重組載體的鑒定

pVITRO/CD8α的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后,顯示約6 300 bp和750 bp左右的片段(圖3)。對(duì)重組質(zhì)粒插入序列進(jìn)行測(cè)序分析,Genebank比對(duì)后顯示為CD8α的cDNA序列。結(jié)果表明,CD8α已成功地克隆入真核表達(dá)載體中。

圖 3 pVITRO/CD8α雙酶切結(jié)果

2.4 CD8α在SP2/0細(xì)胞的表達(dá)

轉(zhuǎn)染 pVITRO/CD8α的 SP2/0細(xì)胞經(jīng) PECD8α的單抗標(biāo)記后用流式細(xì)胞儀檢測(cè),顯示CD8α的表達(dá)率為61%(圖4)。結(jié)果表明,CD8α能在SP2/0細(xì)胞中成功表達(dá)。

2.5 共聚焦顯微鏡檢測(cè)CD8α在SP2/0細(xì)胞中的定位

轉(zhuǎn)染 pVITRO/CD8α的 SP2/0細(xì)胞經(jīng) FITCCD8α單抗標(biāo)記后,置于共聚焦顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示CD8α主要在SP2/0細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)(圖5)。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8α在SP2/0細(xì)胞中的表達(dá)率

圖5 共聚焦顯微鏡檢測(cè)CD8α在SP2/0細(xì)胞中的定位

3 討 論

IKDC是最近發(fā)現(xiàn)的一類既與樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)相似又與NK細(xì)胞相似的多功能嵌合細(xì)胞[6-7]。兼具NK細(xì)胞和DC的功能:與NK細(xì)胞類似,可以產(chǎn)生IFN-γ并通過(guò)膜表面活化性受體NKG2D直接殺傷靶細(xì)胞;在CpG的刺激下,IKDC殺傷功能減弱,但MHCⅡ類分子和共刺激分子的表達(dá)增強(qiáng),從而獲得了與DC類似的抗原提呈功能。IKDC能特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞并且能交叉提呈腫瘤抗原,在腫瘤的免疫治療中具有良好的應(yīng)用前景。但I(xiàn)KDC在小鼠體內(nèi)的含量極少,只占脾臟CD11c+細(xì)胞的1%～2%(約5 000個(gè))和骨髓CD11c+細(xì)胞的 2%[8],遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足過(guò)繼免疫治療所需的細(xì)胞數(shù)。目前體外用可溶性細(xì)胞因子IL-15刺激骨髓來(lái)源的DC可使IKDC得到一定的擴(kuò)增,但擴(kuò)增的效率比較低(僅能出現(xiàn)10～30倍的數(shù)量增長(zhǎng))[9-10]。已有的研究表明,IL-15處于細(xì)胞膜上比其可溶狀態(tài)能更有力刺激NK細(xì)胞的生長(zhǎng):可溶性IL-15刺激只能使NK細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)十倍,而如果將IL-15基因與跨膜蛋白CD8 α基因融合,使IL-15表達(dá)在K562細(xì)胞的表面(膜型IL-15),用該刺激細(xì)胞可使NK細(xì)胞得到大量的擴(kuò)增。因此,對(duì)可溶性IL-15進(jìn)行改造,使其變?yōu)槟け磉_(dá)型IL-15,很有可能達(dá)到體外高效擴(kuò)增IKDC的目的。本研究成功構(gòu)建了含CD8α全長(zhǎng)基因的表達(dá)載體,并證實(shí)其在SP2/0細(xì)胞的細(xì)胞膜上能得到高效表達(dá),為進(jìn)一步構(gòu)建IL-15基因與CD8α基因的嵌合體,獲得膜表達(dá)型的IL-15提供了依據(jù)。

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