何友釗,李 波,劉 勇,蘇 松,袁 慶,陳 川,張孟瑜,劉長安,龔建平

(1.江蘇省無錫市第三人民醫(yī)院肝膽外科,江蘇無錫,214041;2.四川瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科,四川瀘州,646000;3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科,重慶,400010)

肝細(xì)胞肝癌(HCC)對多種化療藥物具有耐藥性在臨床較為常見,其主要原因之一是HCC細(xì)胞中存在多藥耐藥基因(mdr1)及其產(chǎn)物P-糖蛋白(P-gp)和其他耐藥基因及其蛋白表達(dá)的過度表達(dá)。誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶-2(COX-2)與腫瘤的關(guān)系早已被人們關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)COX-2與HCC的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,但COX-2在HCC耐藥性中的作用機(jī)制尚不明確,本研究對此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對象

肝細(xì)胞癌患者52例,均來自本院2003年10月～2005年6月期間肝膽外科住院病人,男39例,女13例,年齡 28～76歲,平均 51.4歲;其中36例患者術(shù)前檢查HBsAg陽性,30例患者存在不同程度的肝硬化,32例患者AFP≥400 μ g/L,術(shù)前Child肝功能分級A級24人,B級28人,按國際抗癌協(xié)會(huì)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期23例,Ⅱ期15例,Ⅲ期14例。腫瘤直徑在1.5～11.0 cm,平均3.8 cm;患者術(shù)前均未行放、化療,所有患者均在全麻下行肝癌切除術(shù),并取部分正常肝組織,術(shù)后病理切片檢查均為原發(fā)性肝細(xì)胞癌,50例為結(jié)節(jié)型肝癌,2例為巨塊型肝癌。

1.2 試劑與引物

鼠抗人P-糖蛋白單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,鼠抗人COX-2單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。COX-2基 因 上 游 引 物:5′-AAAGAAT TCATGCTCGCCCGCGCCCTCT-3′,下游引物序列 :5′-AAATCTAGATTATGACTGTCTTGAAAA A-3′,擴(kuò)增片段328 bp:mdr1基因上游引物:5′-AAAGAATTCGCTCATTCGAGTAGCGGCTC-3′, 下游引物:5′-AAAGTCGACTTACC T TTTATTGTTCAGT T-3′,擴(kuò)增片段 401 bp;β-actin上游引物:5′-AAATGGCAC CACACCT TCTACAA-3′, 下 游 引 物:5′-AAAGCAGCTCGTAGCTCTTCTC C-3′,擴(kuò)增片段372 bp。

1.3 RT-PCR檢測COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表達(dá)

從60例原發(fā)性肝癌中隨機(jī)抽取52例,無菌條件下切取原發(fā)性肝癌及癌周2 cm處肝組織新鮮標(biāo)本,按 TRIZOL試劑盒說明提取組織總RNA,采用RT-PCR檢測其COX-2 mRNA和mdr1 mRNA的表達(dá)。RT-PCR條件:50℃預(yù)變性30 min,94℃變性2 min,55℃退火30 s,72℃延伸 1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),最后72℃補(bǔ)平7 min。取10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠在紫外分析儀下觀察結(jié)果,用Bio-Rad Doc Gel 2000凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照。結(jié)果以相對光密度值(relative optical density,ROD)×面積(A)表示。mRNA相對含量=(目的基因條帶ROD×A)/(βactin條帶 ROD×A)。

1.4 免疫組織化學(xué)SP法檢測COX-2蛋白和P-gp蛋白表達(dá)

全部病理標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定,梯度酒精脫水、二甲苯透明后石蠟包埋,普通切片機(jī)連續(xù)切片(4 μ m),以3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。用10%BSA封閉以減少非特異性著色。再加入相應(yīng)一抗(抗COX-2或P-gp抗體),4℃孵育過夜,PBS洗滌3次后加入1∶200生物素標(biāo)記的二抗工作液,37℃孵育30 min;滴加濃度為1∶200的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育30 min;顯微鏡下監(jiān)測DAB顯色,蘇木精復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、封片。實(shí)驗(yàn)以封閉液代替一抗作陰性對照。兩者染色均為棕黃色,在200倍光鏡下至少觀察5個(gè)視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中腫瘤染色細(xì)胞,(-)陰性:細(xì)胞陽性數(shù)<10%。(+)陽性:>10%的細(xì)胞數(shù)呈陽性反應(yīng)。( )強(qiáng)陽性:>50%的細(xì)胞數(shù)呈陽性反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA在肝癌組織中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示COX-2 mRNA在正常肝組織中無表達(dá),52例HCC組織中有44例HCC組織和癌旁組織中均有表達(dá),其相對表達(dá)量分別為0.724±0.050和0.420±0.068,兩者比較有顯著性差別(P<0.01),其中,11例高分化和32例中、低分化的HCC組織中COX-2mRNA的相對表達(dá)量分別為0.698±0.044和0.762±0.041(P<0.05),在不同臨床分期、腫瘤大小、AFP水平、有無轉(zhuǎn)移的HCC組織之間COX-2 mRNA相對表達(dá)量無顯著性差別(P>0.05)。RT-PCR顯示mdr 1 mRNA在HCC組織、癌旁組織和正常肝組織中均有表達(dá),在HCC組織和癌旁組織中相對表達(dá)量分別為0.675±0.036和0.548±0.033(圖 1)。

圖1 RT-PCR檢測COX-2 mRNA、mdr1mRNA的表達(dá)

2.2 COX-2和P-gp在肝癌組織中的表達(dá)

COX-2的表達(dá)主要定位于胞質(zhì),陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀(圖2),COX-2蛋白在HCC組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為82.7%和23.1%,COX-2在癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁組織(P<0.01)。P-gp表達(dá)主要位于肝癌細(xì)胞膜上,少量位于胞質(zhì)內(nèi),在HCC組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為86.6%和30.7%,P-gp在癌組織中的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁組織(P<0.01)。

圖2 COX-2和P-gp在HCC組織中的表達(dá)

2.3 COX-2 mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

全部HCC組織中有42例同時(shí)表達(dá)出COX-2 mRNA和mdr 1 mRNA,兩者的相對表達(dá)量分別為0.725±0.050和0.574±0.036,相關(guān)分析表明COX-2 mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.563,P<0.01,圖3)。

圖3 COX-2mRNA與mdr 1 mRNA在HCC組織相對表達(dá)量關(guān)系的散點(diǎn)圖

2.4 COX-2的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

將52例HCC標(biāo)本按分化程度、是否合并HBsAg及肝硬化、腫瘤大小、AFP水平、TNM 分期及是否轉(zhuǎn)移等臨床特征分類,統(tǒng)計(jì)COX-2的陽性表達(dá)與HCC組織臨床特征的關(guān)系(表1)。由表1可見,在癌組織中,高分化的HCC組織COX-2的表達(dá)陽性率為61.1%(11/18),低分化及分化較差的HCC組織為94.1%(32/34),分化程度高的HCC組織中COX-2的陽性表達(dá)率明顯低于低分化及分化較差HCC組織中COX-2的表達(dá)。HBsAg陽性HCC組織中COX-2表達(dá)率91.7%(33/36)明顯高于HBsAg陰性HCC組織中COX-2的表達(dá) 62.5%(10/16,P<0.05)。

表1 C OX-2表達(dá)與HC C臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

環(huán)氧化酶(COX)是花生四烯酸或其他二十碳脂肪酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵限速酶,主要參與機(jī)體的炎癥和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其中COX-2通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制免疫應(yīng)答,促進(jìn)腫瘤新生血管的形成等機(jī)制,參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[1]。近年來研究表明,COX-2與腫瘤發(fā)生具有明顯關(guān)系,許多腫瘤,如結(jié)腸癌,乳腺癌,前列腺癌,肺癌,肝癌等COX-2呈高表達(dá)狀態(tài),并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要的作用[2]。在HCC組織中COX-2表達(dá)與分化程度有密切關(guān)系,總體而言在正常肝臟組織中COX-2不表達(dá),高分化HCC組織中COX-2的表達(dá)明顯強(qiáng)于中、低分化的HCC組織,早期HCC通常分化較好,提示COX-2在HCC發(fā)生的早期階段起著重要作用[3]。在高分化的HCC,COX-2表達(dá)高于低分化的HCC和正常肝組織,表明COX-2可能在HCC發(fā)生早期具有重要作用,在HCC病人COX-2表達(dá)增加其預(yù)后較差,在慢性肝炎組織尤其是肝硬化組織中COX-2的表達(dá)也是顯著升高的,因此,COX-2在肝硬化進(jìn)展為HCC的過程中起重要的促進(jìn)作用,可能是COX-2過度表達(dá)改變了細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞發(fā)生惡性變化[4]。但是,我們檢測表明中、低分化HCC組織中 COX-2陽性表達(dá)高于分化較好的HCC組織,COX-2陽性表達(dá)在HBsAg陽性HCC組織高于HBsAg陰性的HCC組織,推測COX-2在乙肝患者中HBV引起肝細(xì)胞的變性過程中起著重要作用。此外,我們發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)水平與AFP表達(dá)高低、是否轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及臨床病理分期無顯著相關(guān),提示COX-2的表達(dá)與HCC的預(yù)后關(guān)系不大。

多藥耐藥現(xiàn)象(MDR)是導(dǎo)致HCC化療失敗的主要因素,MDR是指腫瘤對某種抗腫瘤藥產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。肝癌的MDR形成的機(jī)制較為復(fù)雜,與多種耐藥基因及其蛋白表達(dá)有密切關(guān)系,但是mdr1基因和P-gp是導(dǎo)致肝癌具有MDR的主要機(jī)制。P-gp是細(xì)胞膜蛋白,ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員,通過消耗能量從腫瘤細(xì)胞中泵出抗癌藥物。已有證據(jù)表明,在HCC多藥耐藥性與COX-2過度表達(dá)有關(guān),COX-2過度表達(dá)可以上調(diào) mdr1基因和P-gp的表達(dá)[5]。有研究表明肝癌細(xì)胞MDR的形成同時(shí)伴有COX-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)。P-gp和COX-2常常同時(shí)在HCC表達(dá)增強(qiáng),與MDR有關(guān)并且預(yù)后較差,COX-2可以誘導(dǎo)P-gp表達(dá),使用COX-2特異性抑制劑塞來昔布(Celecoxib)作用于表達(dá)P-gp的HCC耐藥株,發(fā)現(xiàn)10 mmol/L的塞來昔布可以減低P-gp、Bcl-xL和Bcl-2表達(dá),在MDR肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)Bax從胞漿易位到線粒體,導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放至胞漿,原因在于caspase-3活化導(dǎo)致凋亡增加,50 mmol/L的塞來昔布輕微增加COX-2和P-gp的表達(dá),沒有改變Bcl-xL和Bcl-2的表達(dá)[6]。本研究表明COX-2和P-gp在肝細(xì)胞癌中表達(dá)具有明顯的相關(guān)性,證實(shí)了COX-2參與了HCC的多藥耐藥機(jī)制。COX-2可以作為逆轉(zhuǎn)HCC耐藥性的一個(gè)靶點(diǎn),選擇性抑制COX-2活性可能作用于P-gp,增加抗癌藥物濃度,降低對抗癌藥物的耐藥性,增強(qiáng)常規(guī)化療療效。

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