劉漢文 王愛(ài)民 陳洪興 張其林

小龍蝦學(xué)名克氏原螯蝦，俗稱淡水小龍蝦。每只龍蝦的可食比率為20%～30%，但是在國(guó)內(nèi)的小龍蝦加工中，除將蝦殼加工為甲殼素，甲殼素脫乙?；笤僦瞥蓺ぞ厶峭?，較少進(jìn)行綜合利用。蝦殼酸堿交替法生產(chǎn)的甲殼素，蝦青素與蛋白質(zhì)流失于廢水中，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。殼聚糖分子中具有大量的游離氨基，在一定條件下，能夠表現(xiàn)出陽(yáng)離子型聚電解質(zhì)的性質(zhì)，具有強(qiáng)烈的絮凝作用，既有鋁鹽、鐵鹽消除膠粒外面負(fù)電荷的作用，又有以聚丙烯酰胺為代表的有機(jī)高分子類絮凝劑通過(guò)“橋聯(lián)”使懸浮物凝聚的作用，因此，它能夠使甲殼素生產(chǎn)廢水中的懸浮物快速沉降，是一種天然、無(wú)毒、無(wú)味的高分子絮凝劑[1-2]。

蝦青素，學(xué)名為3，3′-二羥基-4，4′-二酮基-β，β′胡蘿卜素，屬于葉黃族酮式類胡蘿卜素，易溶于有機(jī)溶劑，難溶于水，具有獨(dú)特的著色、抗氧化、防癌[3-4]、促進(jìn)抗體產(chǎn)生、抵御紫外線、改善視力、提高免疫力、促進(jìn)色素形成以及改善生育等功能[5]。蝦青素可作為人類高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健品、醫(yī)藥產(chǎn)品及養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料添加劑，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上，蝦青素市場(chǎng)需求量很大。蛋白質(zhì)是動(dòng)物有機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是動(dòng)物體生長(zhǎng)和維持生命活動(dòng)必需的營(yíng)養(yǎng)素。近年來(lái)，動(dòng)物性蛋白質(zhì)飼料匱乏，給飼料工業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了不少困難。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)報(bào)道，當(dāng)前在世界范圍內(nèi)蛋白質(zhì)飼料嚴(yán)重不足，而且這種狀況在逐年加劇。從廢棄物中回收提取蛋白質(zhì)是開(kāi)發(fā)新的蛋白質(zhì)飼料很重要的一條途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

小龍蝦殼（鹽城市邦尼水產(chǎn)食品有限公司生產(chǎn)）；殼聚糖(脫乙酰度≥90%，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；蛋白酶[食用級(jí)，由諾維信（中國(guó)）生物科技有限公司生產(chǎn)]。

1.2 試劑

鹽酸、硫酸、冰醋酸、硼酸、氫氧化鈉、五水硫酸銅、硫酸鉀、二氯甲烷、無(wú)水乙醇、甲醛、甲基紅、溴甲酚綠（以上試劑皆為分析純）。

1.3 設(shè)備

電熱真空干燥箱，型號(hào)為ZK-65；電熱恒溫水浴鍋，型號(hào)為HHS；恒溫干燥箱，型號(hào)為CS101-2E；分光光度計(jì)，型號(hào)為7202B；酸度計(jì)，型號(hào)為pHS-3C；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，型號(hào)為RE-2000；均漿機(jī)，型號(hào)為JJ-2；噴霧干燥塔，型號(hào)為GZ-5；粉碎機(jī)，型號(hào)為SF-200；凱氏定氮裝置、抽濾裝置、磁力攪拌器、滴定裝置等。

1.4 方法

1.4.1 工藝流程

1.4.2 采用酸堿交替法制備甲殼素

將小龍蝦殼洗凈，低溫風(fēng)干，粉碎。用2 mol/l鹽酸溶液浸泡，攪拌，反應(yīng)24 h，水洗至中性，鹽酸具有脫去蝦殼中的碳酸鈣等無(wú)機(jī)物作用，同時(shí)蝦殼中的油脂類會(huì)析出，蝦青素就會(huì)進(jìn)入溶液；再用過(guò)量10%NaOH煮沸1～2 h，水解除去蝦殼中所含的蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)結(jié)合的蝦青素會(huì)隨之溶出，水洗至中性，可制備甲殼素。

1.4.3 廢水絮凝處理

收集甲殼素生產(chǎn)過(guò)程中廢水，調(diào)節(jié)pH值，投入一定量的殼聚糖酸性溶液作為絮凝劑，攪拌2 min，靜置一定時(shí)間，使蝦青素與蛋白質(zhì)絮凝沉淀，殼聚糖不會(huì)污染回收后的蛋白質(zhì)，無(wú)需后續(xù)處理。

1.4.4 蛋白質(zhì)的水解與蝦青素的提取

在龍蝦殼中，蝦青素主要以酯化形式存在，所以用有機(jī)溶劑直接提取蝦青素得率較低，在甲殼素生產(chǎn)廢水的絮凝物中，部分蝦青素仍與蛋白質(zhì)以化學(xué)鍵的形式結(jié)合在一起，將蝦青素與蛋白質(zhì)絮凝物均漿，采用蛋白酶將蛋白質(zhì)適度降解，蛋白質(zhì)中結(jié)合的蝦青素得以有效釋放，本試驗(yàn)采用蛋白酶酶解后，以二氯甲烷為萃取劑，重復(fù)萃取多次至上清液無(wú)色，合并上清液，將萃取液轉(zhuǎn)入蒸餾燒瓶中真空水浴加熱回收二氯甲烷，至二氯甲烷完全回收。將固體物用乙醇溶解，過(guò)濾，利用蝦青素在酸性條件下溶解度低的特性，用1 mol/l鹽酸沉降蝦青素，去上清液，如此反復(fù)2～3次，得到蝦青素的純凈沉淀物[6-8]。將制得的純凈沉淀物放在50～55℃的真空干燥箱中烘干，得到鮮紅色粉末狀固體，即為蝦青素提取物。最大量提取蝦青素并使降解后的蛋白質(zhì)成為富含游離氨基酸、小分子肽的水解蛋白。水解蛋白具有提高鮮度，增加風(fēng)味的作用，將水解蛋白濃縮，噴霧干燥后，可作為動(dòng)物蛋白及高檔水產(chǎn)動(dòng)物蛋白調(diào)味料。

1.4.5 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.5.1 絮凝效果的測(cè)定方法

取一定量的甲殼素生產(chǎn)過(guò)程中廢水，放入三角瓶中，配制1%殼聚糖醋酸水溶液，在不同的pH值下，按一定的比例加入1%殼聚糖醋酸水溶液作為絮凝劑，靜置一定的時(shí)間，布氏漏斗雙層濾紙抽濾收集絮凝沉淀。抽濾液在730 nm的波長(zhǎng)下用分光光度法測(cè)其吸光值，吸光值越低，絮凝效果越好[9]。

1.4.5.2 蝦青素提取率

提取率（%）=(真空干燥后的蝦青素提取物質(zhì)量/風(fēng)干小龍蝦殼質(zhì)量)×100。

1.4.5.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

微量凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.4.5.4 蛋白質(zhì)的水解度

水解度（%）=（氨基態(tài)氮含量/總氮含量）×100。

氨基態(tài)氮含量的測(cè)定按《游離氨基氮甲醛快速滴定法》進(jìn)行測(cè)定；總氮含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦殼以酸堿交替法制備甲殼素廢水的殼聚糖絮凝處理

2.1.1 調(diào)節(jié)pH值對(duì)廢水的影響

分別取50 ml的廢水，加入到三角燒瓶里，調(diào)節(jié)pH值2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，攪拌2 min，靜置2 h，抽濾，抽濾液在730 nm處下測(cè)OD值。結(jié)果見(jiàn)圖1，pH值為4時(shí)絮凝效果最好。

圖1 pH值對(duì)廢水OD值的影響

2.1.2 絮凝劑最佳用量的測(cè)定

取6等份（每份為50 ml）廢水調(diào)節(jié)pH值為4.0，然后分別加入0、2、4、6、8 ml和10 ml的1%殼聚糖醋酸水溶液，然后攪拌2 min，靜置2 h，抽濾，抽濾液在730 nm處下測(cè)OD值。結(jié)果見(jiàn)圖2，加入1%殼聚糖醋酸水溶液4 ml后絮凝效果最好。

圖2 加入殼聚糖絮凝劑后對(duì)OD值的影響

2.1.3 最佳絮凝時(shí)間的測(cè)定

取6等份（每份為50 ml）廢水調(diào)節(jié)pH值為4.0，加入1%殼聚糖醋酸水溶液4 ml，攪拌2 min，然后分別絮凝0.5、1、2、3、4 h和5 h,抽濾，抽濾液在730 nm處下測(cè)OD值。結(jié)果見(jiàn)圖3，靜置時(shí)間3 h絮凝效果最好。

圖3 絮凝時(shí)間對(duì)OD值的影響

2.2 絮凝工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)試驗(yàn)2.1，以調(diào)節(jié)廢水pH值、每升廢水中加入1%殼聚糖醋酸水溶液體積和絮凝時(shí)間為影響因素，以布氏漏斗雙層濾紙抽濾液在730 nm處下測(cè)定的OD值為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可以看出，R1＞R2＞R3，各因素影響次序?yàn)椋簆H值＞每升廢水中加入1%殼聚糖醋酸水溶液體積＞絮凝時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B2C1，即調(diào)節(jié)pH值為4.0、1%殼聚糖醋酸水溶液絮凝加入量為80 ml/l、絮凝時(shí)間為2 h。

根據(jù)上述正交試驗(yàn)結(jié)論，調(diào)節(jié)pH值為4.0、每升廢水中加入1%殼聚糖乙酸水溶液80 ml、絮凝時(shí)間2 h，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果抽濾液中吸收光度達(dá)0.081 60，廢水絮凝效果最好。用微量凱氏定氮法測(cè)定廢水原液與絮凝物蛋白含量，蛋白質(zhì)的回收率為88.6%。

2.3 蛋白酶水解與蝦青素的提取

2.3.1 蛋白酶水解絮凝物對(duì)水解度的影響

以優(yōu)化后的絮凝工藝條件，絮凝廢水中的蝦青素與蛋白質(zhì)，試驗(yàn)中研究了4種蛋白酶（風(fēng)味酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）水解工藝條件，在初始pH值6.5，水解溫度55℃下，按固液比為1∶1.5加水，酶的添加量均為1.5 g/kg絮凝物，酶解一定時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 蛋白酶水解絮凝物對(duì)水解度的影響

從圖4中可以看出，風(fēng)味酶（Flavourzyme）的水解效果最好，風(fēng)味酶是一種內(nèi)切酶和外切酶的復(fù)合物，能高度水解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的肽和氨基酸能賦予產(chǎn)品更多的香味和更飽滿的風(fēng)味。

2.3.2 風(fēng)味酶用量對(duì)蝦青素提取率的影響

圖5 風(fēng)味酶用量對(duì)蝦青素提取率的影響

根據(jù)風(fēng)味酶適宜在50～60℃、pH值6.0～6.5的條件下反應(yīng)，在初始pH值6.5、溫度55℃下，以固液比為1∶1.5加水，分別按照每千克絮凝物添加0.6、0.9、1.2、1.5、1.8和2.1 g酶的比例添加風(fēng)味酶，蛋白酶保溫酶解時(shí)間6 h，測(cè)定蝦青素提取率，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著風(fēng)味酶用量的增加，蛋白底物的水解度明顯加大,當(dāng)酶的添加量達(dá)到1.5 g/kg絮凝物時(shí)，水解度的增加逐漸緩慢下來(lái)，綜合考慮蛋白酶的使用成本和生產(chǎn)工藝需要，蛋白酶的添加量為1.5 g/kg。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響

按照1.5 g/kg絮凝物的比例添加風(fēng)味蛋白酶，在初始pH值6.5、溫度55℃下，分別保溫酶解2、3、4、5、6和7 h，測(cè)定蝦青素提取率，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)蝦青素提取率的影響

從圖6中可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦青素的提取率逐步增大,當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)4 h后，蝦青素的提取率逐步降低，這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白酶會(huì)對(duì)蝦青素產(chǎn)生破壞作用。酶解時(shí)間定為4 h。

2.3.4 固液比對(duì)蝦青素提取率的影響

圖7 固液比對(duì)蝦青素提取率的影響

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)絮凝物加水，采用1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3的固液比，在初始pH值6.5、溫度55℃下，選用風(fēng)味酶1.5 g/kg絮凝物，保溫酶解時(shí)間4 h，測(cè)定蝦青素提取率，結(jié)果如圖7所示。

從圖7可以看出，在固液比達(dá)到1∶2時(shí)，蝦青素提取率可達(dá)4.49%。該條件下蛋白質(zhì)的水解度為23.8%。將提取蝦青素后的蛋白質(zhì)濃縮，噴霧干燥，制成蛋白制品，產(chǎn)品不苦，有較好的風(fēng)味。

3 結(jié)果與討論

3.1 以小龍蝦殼為原料，按酸堿交替法生產(chǎn)甲殼素，蛋白質(zhì)和蝦青素等物質(zhì)流失于廢水中，采用天然、無(wú)毒、無(wú)味的殼聚糖作絮凝劑，可將蝦青素與蛋白質(zhì)絮凝沉淀。試驗(yàn)表明：調(diào)節(jié)pH值4.0，每升廢水中添加80 ml 1%殼聚糖乙酸水溶液，靜置2 h，廢水中溶液的透光率最低，絮凝物蛋白質(zhì)回收率達(dá)88.6%。

3.2 以殼聚糖在最佳條件下絮凝小龍蝦殼酸堿交替法制備甲殼素產(chǎn)生的廢水，比較了幾種蛋白酶水解絮凝物的蛋白質(zhì)水解度，其中風(fēng)味蛋白酶的水解度最高。采用風(fēng)味蛋白酶酶解殼聚糖絮凝物，用二氯甲烷為萃取劑，重復(fù)萃取多次至上清液無(wú)色，真空水浴加熱回收二氯甲烷，再用乙醇溶解沉淀物，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值沉降蝦青素，真空干燥，測(cè)定蝦青素的質(zhì)量，計(jì)算蝦青素的提取率。試驗(yàn)表明：在初始pH值6.5，溫度55℃下，選用風(fēng)味酶1.5 g/kg絮凝物，固液比1∶2時(shí)，保溫酶解時(shí)間4 h，蝦青素提取率可達(dá)4.49%。該條件下，蛋白質(zhì)的水解度為23.8%。熊漢國(guó)等[10]以乙醇為溶劑，以乙醇濃度95%、溫度70℃、0.5 h，龍蝦中蝦青素提取率可達(dá)4.92%。本工藝從小龍蝦殼加工甲殼素廢水中提取蝦青素，提取率偏低，仍有極少部分蝦青素流失。

3.3 用風(fēng)味蛋白酶對(duì)小龍蝦殼加工過(guò)程中的副產(chǎn)品蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，提取蝦青素并將水解后蛋白質(zhì)濃縮，噴霧干燥，制成水解動(dòng)物蛋白，產(chǎn)品沒(méi)有因水解度不合適而產(chǎn)生苦味的的問(wèn)題，具有良好的風(fēng)味。

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