張利峰，劉來福，王 姝

（北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026）

引言

測量審核（Measurement Audits）是實驗室對被測物品（材料或制品）進行實際測試，將測試結(jié)果與測量審核機構(gòu)提供的參考值進行比較的活動。通俗的講，測量審核是能力驗證計劃的有效補充，是一對一的能力驗證計劃，是經(jīng)過權(quán)威認可機構(gòu)認可的運行科學規(guī)范的實驗室間比對，測量審核數(shù)據(jù)是中國合格評定國家認可委員會（CNAS）判斷實驗室能力的重要技術(shù)依據(jù)。國際標準ISO/IEC:17043是指導(dǎo)各國開展測量審核和能力驗證活動的權(quán)威標準，CNAS的能力驗證處、實驗室處、檢查機構(gòu)處等部門可以通過利用測量審核和能力驗證這種外部質(zhì)量保證（EQA）工具，識別與國際同行機構(gòu)之間的管理差異，補充其內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，為自身的持續(xù)改進和質(zhì)量管理提供信息。實驗室的用戶、監(jiān)督和管理機構(gòu)、評價機構(gòu)等可通過利用CNAS測量審核結(jié)果，判斷實驗室和檢查機構(gòu)等是否具有從事校準／檢測活動的能力，以及監(jiān)控他們能力的持續(xù)狀況。

相對于能力驗證計劃的組織受到項目方案設(shè)計、樣品制備、參加實驗室數(shù)量以及費用投入等多種因素的制約，每年實施的項目十分有限。而測量審核活動可以采用能力驗證計劃項目、有證參考物質(zhì)等多種類型的已獲得指定值的試驗樣品，故更具廣泛性、常態(tài)性和實時性。目前，測量審核活動在我國還處于剛起步階段，經(jīng)過前幾年CNAS在實驗室測量審核參考比對機構(gòu)認定工作研究探索的基礎(chǔ)上，2010年2月發(fā)布了CNAS認可委（秘）（2010）16號文件《關(guān)于測量審核指定機構(gòu)相關(guān)事宜的通知》，發(fā)布了《測量審核指定機構(gòu)管理辦法》以期完善測量審核活動的管理。在該辦法中測量審核首次明確定義為“合格評定機構(gòu)對被測物品（材料或制品）進行校準/檢測，將校準/檢測結(jié)果與參考值進行比較的活動?！笔怪c能力驗證活動相得益彰，互補完善，成為了評價實驗室檢測和校準技術(shù)能力的又一重要手段。

在動物檢疫領(lǐng)域的測量審核活動方面，我國正處于剛起步階段。我國在動物檢疫測量審核用樣品的研究制備及樣品庫的建設(shè)與管理方面還屬于空白。最突出的問題就是我們還沒有系統(tǒng)研究和建立起一個與動檢領(lǐng)域測量審核需求相適應(yīng)的種類齊全、科學可靠、管理和可量值溯源的測量審核用樣品庫。

隨著世界上動檢領(lǐng)域高新測量技術(shù)的飛速發(fā)展，需要品種越來越多、品質(zhì)越來越高的測量審核用樣品。開展動物檢疫實驗室檢測能力的確認將主要依賴于是否擁有具有生物學特性量值的約定標度的復(fù)現(xiàn)與溯源的測量審核用樣品。可以說，測量審核用樣品的研制已經(jīng)進入了一個最具活力、最富創(chuàng)新性和最有生命力的發(fā)展階段，測量審核用樣品在國民經(jīng)濟建設(shè)中顯示出巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和科學價值。

1 動檢領(lǐng)域測量審核樣品的基本特點

在測量審核用樣品的研制方面，動物檢疫領(lǐng)域有很多獨特的方面，具體分析大致有以下幾種基本特點。

1.1 動檢領(lǐng)域尚處于定性檢測階段

測量是依據(jù)一定的法則，將某種物體或現(xiàn)象所具有的屬性或特征用數(shù)字或符合表示的過程。它不僅可以對事物的屬性做定量的說明（即確定特定屬性的水平），也可以對事物的屬性做定性的說明（即確定特定屬性的類別）。動物檢疫領(lǐng)域目前尚處于定性檢測的階段，諸如ELISA試驗、瓊脂擴散試驗、血凝抑制試驗、PCR和實時熒光PCR試驗、中和試驗、病毒分離試驗等等，這些動檢領(lǐng)域經(jīng)常使用的檢驗方法，或者是以圖形形式，或者是以相對的數(shù)據(jù)形式來反映檢驗結(jié)果，但是最終由于尚無嚴格意義上的不確定度等數(shù)據(jù)作為支撐，均屬于定性結(jié)果的范疇，也就是統(tǒng)計學上常說的屬于定名試驗而不是定序試驗。因此，目前的一些針對定序試驗所設(shè)計的一些統(tǒng)計學方法如Z比分數(shù)、En值等尚不適用于動檢領(lǐng)域，而動檢領(lǐng)域常用的Cv變異系數(shù)的統(tǒng)計方法是否適用于動檢領(lǐng)域的測量審核或能力驗證結(jié)果的評價尚無定論。

1.2 生物安全

如涉及的檢疫對象有的是一類病原微生物，有的是二類病原微生物，在其處理、檢疫和運輸過程中要注意很多生物安全的方面。

1.3 生物活性和穩(wěn)定性

樣品都是具有生物活性的病原微生物或者是抗體或者是核酸序列等等，相對應(yīng)的就是樣品的穩(wěn)定性檢驗需要特別重視。

1.4 病原微生物的變異性導(dǎo)致的測量審核樣品的時效性

動物病原微生物核酸序列、蛋白構(gòu)象、毒力等等的不斷變異，以及因此導(dǎo)致的相應(yīng)抗體也隨之而變化的情況，要求動檢領(lǐng)域測量審核樣品的研制工作需要及時跟蹤和分析研究最新的疫病分子生物學和流行病學變化情況，及時調(diào)整和重新研制相應(yīng)的測量審核樣品。

1.5 生物樣品成份的復(fù)雜性、相互干擾性和非種屬特異性

現(xiàn)代的疫病診斷技術(shù)如 PCR、熒光PCR、ELISA、血凝抑制、中和試驗、病毒分離實驗等等檢測和診斷技術(shù)，往往都有其技術(shù)方法的局限性，只能從某一個角度證明被檢物品的某一特性值的存在，最終的確診需要綜合多種檢測方法所獲得的數(shù)據(jù)才能下定結(jié)論。這其中的原因就是生物樣品成份的復(fù)雜性、相互干擾性和非種屬特異性等方面。

關(guān)于分子生物學標準物質(zhì)/標準樣品的研制工作，在《標準物質(zhì)和標準樣品生產(chǎn)者認可準則CNAS-CL04:2007）》中提到，該領(lǐng)域曾經(jīng)只是一個專門研究領(lǐng)域，但目前逐漸達成共識:商業(yè)開發(fā)的測量程序和過程都必須驗證，無論它們是為疾病的防治和測定提供幫助，還是為實施法律及法醫(yī)科學提供服務(wù)，還是對制造遺傳工程食品和藥品進行控制的。很顯然，這是需要很多新的標準物質(zhì)/標準樣品，但是，最近人們才充分意識到這項工作的復(fù)雜性。

2 動檢領(lǐng)域測量審核用樣品制備關(guān)鍵點探索

新的ISO/IEC 17043:2010《合格評定-利用實驗室間比對的能力驗證》已經(jīng)正式發(fā)布，該標準為實施實驗室能力驗證的組織的能力規(guī)定了國際協(xié)調(diào)一致的要求，明確了測量審核的作用和意義。在動檢領(lǐng)域開展測量審核尚屬于起步階段，有關(guān)動檢測量審核的樣品制備、結(jié)果評價等方面都有待探索。

2.1 樣品適用那些檢測標準方法的研究

在進行評價參加測量審核的實驗室的能力確認時，要盡量選擇能體現(xiàn)具體項目檢測能力的方法，而且要采用盡量多的方法。在制備測量審核樣品時，要掌握該種疫病的主要檢測標準和方法的適用范圍，分析不同檢測標準和方法之間的區(qū)別和差異。明確所研制的測量審核樣品適用于那些標準，不適用于那些標準。要對檢測對象的目標基因片段、目標蛋白、不同亞型的菌毒種的區(qū)別差異之處，如毒力差異、基因突變的差異、蛋白構(gòu)相的差異等等了如指掌。

2.2 檢測試劑的差異性及其結(jié)果判定之間的異同

應(yīng)了解和掌握目前市場上常用的該種疫病檢測試劑的異同。也包括所用細胞、雞胚、實驗動物等等影響因素。即使是同一種檢測方法，但是由于所使用的檢測試劑盒生產(chǎn)廠家不一樣，在結(jié)果判定之時也有異同，應(yīng)注意到這些差異，了解所制備樣品與該種檢測試劑之間的吻合度。

2.3 檢測設(shè)備之間的差異性

由于同類型檢測設(shè)備所使用的硬件、分析軟件和耗材不一樣，如不同生產(chǎn)廠家的熒光PCR儀，在對同一樣品進行分析時也會有一些差異，因此，應(yīng)了解和掌握所制備樣品在同類型設(shè)備上的表現(xiàn)。

2.4 擬制備測量審核樣品的溯源性及溯源鏈

測量審核樣品是合格評定機構(gòu)對被測物品進行檢測，將檢測結(jié)果與參考值進行比較的活動。因此，該被測物品的溯源性非常重要。但是，正如曹實等在關(guān)于醫(yī)學校準實驗室溯源性問題中所提到的目前常規(guī)的醫(yī)學臨床檢驗項目大約有400～700個能溯源至SI單位的僅有50個左右，大多數(shù)項目因其檢測生物源性樣品的復(fù)雜性 ，被測量定義的復(fù)雜性等原因其量值溯源停留在較低的計量學水平。在動檢領(lǐng)域這方面的溯源性問題基礎(chǔ)就更加薄弱。

2.5 測量審核樣品的制備

2.5.1 原料選擇原則

原料應(yīng)具有高度穩(wěn)定性和適合檢測或試驗要求的特異性，不應(yīng)含有干擾使用目的的雜質(zhì)；盡可能使樣品在性質(zhì)上與供試品相對一致；必須具有足夠數(shù)量的原料，以滿足多年使用的需要。

2.5.2 樣品特性值的標定

初步標定:選好原料后，根據(jù)各種樣品的不同要求，用適宜的保護緩沖液稀釋，然后用國際參考試劑進行初步標化，大體確定其效價單位數(shù)。

樣品的分裝，凍干和熔封:將上述初步標定的樣品精確分裝。需要干燥保存者分裝后立即進行凍干和熔封。整個分裝、凍干和熔封過程，必須密切注意各安瓿間效價和穩(wěn)定性的一致性。

正式標定:樣品應(yīng)進行效價測定，特異活性穩(wěn)定性試驗，無菌試驗。凍干樣品還應(yīng)進行水分測定和真空度檢查。

效價協(xié)作標定:以國際同類標準品為依據(jù)，組織有關(guān)單位參加，對樣品的效價進行協(xié)作標定，標定結(jié)果必須經(jīng)統(tǒng)計學處理，以確定樣品的特性值。

2.5.3 樣品的檢驗分析、評價等需要研究分析的其它相關(guān)因素

樣品特性值不確定度的探索、樣品的均勻性檢驗、樣品的穩(wěn)定性檢驗、樣品保存條件和保質(zhì)期的研究、樣品運輸包裝條件研究、參比實驗室結(jié)果的評價原則研究、相應(yīng)樣品的生產(chǎn)規(guī)程和質(zhì)量控制規(guī)范的編制。

3 動檢領(lǐng)域測量審核用樣品庫建設(shè)的研究與實踐

實驗室評審的現(xiàn)場考核具有時間短等局限性，而專家攜帶樣品前往考核具有爭議性、權(quán)威性和不方便等問題。測量審核則解決了這個問題。而且測量審核樣品要比標準物質(zhì)更便宜。

以北京檢驗檢疫局動檢實驗室為例，實驗室在相關(guān)科研項目的支撐下，按照上述測量審核樣品研制要求，制備了相應(yīng)的測量審核樣品，建立了一個管理科學規(guī)范、樣品能夠適用于測量審核目的、不會在運輸途中發(fā)生性質(zhì)改變、可以隨時向需要提供測量審核試驗的實驗室提供樣品及能夠和國外的能力驗證提供者或者參考實驗室進行檢測結(jié)果比對的一個動物檢疫實驗室測量審核用樣品庫，包括有禽流感、新城疫、豬鏈球菌、口蹄疫、鯉春病、傳染性造血器官壞死病和白斑病等測量審核樣品。在具體建設(shè)過程中，主要進行了以下幾方面的工作。

3.1 測量審核樣品庫硬件體系建設(shè)實踐探索

3.1.1 樣品冷凍保存硬件建設(shè)

動檢領(lǐng)域生物樣品一般都需要冷凍或冷藏保存，在冷鏈條件下運輸。在研究了動檢領(lǐng)域不同測量審核樣品的最佳儲存條件之后，我們專門購置了2臺-80℃超低溫冰箱，用于長期凍存核酸樣品和血清樣品。配置了雙路供電系統(tǒng)，確保了供電保障問題。配備了空調(diào)系統(tǒng)，確保環(huán)境溫度的適宜。

3.1.2 樣品庫安全措施硬件建設(shè)

為保障測量審核樣品及其病原微生物菌毒種的生物安全和防盜、防火等安全問題。專門為樣品庫設(shè)置了一間房屋，實行了雙人雙鎖，建設(shè)了紅外線防盜、電子遙控卷簾門、門禁卡開啟等安防措施。

3.1.3 冰柜溫度監(jiān)控系統(tǒng)建設(shè)

為了24小時監(jiān)控冰柜的溫度波動，實時掌握和及時采取相應(yīng)措施，保障樣品庫冰柜的溫度在一個適宜的溫度范圍內(nèi)，確保樣品的保存效果。我們?yōu)闃悠穾彀惭b了?；蹖崟r環(huán)境溫濕度無線監(jiān)測系統(tǒng)。每半個小時樣品庫的溫度探測儀發(fā)生一次實時的溫度情況，通過無線網(wǎng)絡(luò)，在一臺監(jiān)控電腦上記錄和儲存樣品庫的溫度變化情況，如果發(fā)生溫度異常，系統(tǒng)會實時自動發(fā)生短信到綁定的監(jiān)控人的手機上，提示樣品庫監(jiān)控人員有異常情況。

3.2 測量審核樣品庫軟件體系建設(shè)實踐探索

3.2.1 樣品標識和軟件管理系統(tǒng)

將制備好的測量審核樣品儲存在專門的冷凍盒里，每管樣品上面都有清晰的樣品標簽信息，每種樣品的凍存盒上都有唯一的條形碼。通過樣品管理軟件，將其掃描后輸入樣品制備的信息、特性值、數(shù)量、儲存位置、存取調(diào)用記錄和時間、樣品有效性狀態(tài)等信息。

3.2.2 測量審核樣品庫管理體系文件的建設(shè)

編制樣品庫的管理體系文件，負責樣品的日常維護，以確保其保持技術(shù)性能和適宜開展對應(yīng)指定能力的測量審核。

制定樣品庫的使用、維護、更新和管理辦法；建立樣品一覽表，樣品檔案和制備樣品的技術(shù)說明書；便于檢索和調(diào)用；記錄樣品特性值漂移情況，明確各種樣品定期監(jiān)測的周期（根據(jù)目前數(shù)年來積累的數(shù)據(jù)分析，血清樣品和添加了核酸保護劑的核酸樣品在-80℃冰箱的保存條件下，至少1年內(nèi)樣品有很好的穩(wěn)定性）；建立測量審核活動的記錄表格，如測量審核證書、測量審核結(jié)果報告、測量審核樣品發(fā)送表、測量審核樣品檔案、測量審核樣品收樣確認表等；樣品包裝和運輸技術(shù)要求。

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