張 麗 ，楊蓮茹 ，吳紹強(qiáng)

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100029）

核酸的分子生物學(xué)技術(shù)是進(jìn)行病原微生物檢測，物種鑒定，物種起源、多樣性評估及其親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化等常用研究手段之一[1]。然而，能否提取出高質(zhì)量的核酸分子則是核酸分子生物學(xué)試驗中關(guān)鍵，提取方法的靈敏度、特異性也將直接關(guān)系到后續(xù)試驗的成敗。

1869年，瑞士醫(yī)師Friedrich Miescher首例成功的進(jìn)行了核酸提取[2]。起初，他關(guān)注于組成白細(xì)胞各種蛋白質(zhì)，并指出蛋白質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)的主要成分。但在隨后的測試試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入酸性溶液時溶液中生成一種沉淀物，再加入堿性溶液時沉淀繼而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功從細(xì)胞中提取出DNA后，一些研究者紛紛效仿，并在材料、試劑的應(yīng)用上進(jìn)行了不斷的探索，由此發(fā)展了許多核酸的生物分子提取技術(shù)?，F(xiàn)如今，從硫氰酸胍鹽-苯酚-氯仿提取法到柱純化技術(shù)，已被廣泛地用于DNA和RNA的提取。

核酸提取的關(guān)鍵在于組織細(xì)胞的裂解和核酸純化兩大步驟，本文據(jù)此對核酸提取的研究進(jìn)展進(jìn)行分析和討論。

1 組織細(xì)胞裂解方法

組織細(xì)胞裂解提取核酸的方法主要包括胍鹽裂解法、堿裂解法、CTAB裂解法以及酚抽提法等。

1.1 胍鹽裂解法

胍鹽是蛋白強(qiáng)變性劑，核酸提取一般采用高濃度的胍鹽來裂解細(xì)胞，促使核蛋白體解離，同時高濃度的胍鹽能使細(xì)胞內(nèi)核酸酶失活，使釋放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich 等[3]首次使用異硫氰酸胍從總RNA中分離純化出mRNA。該方法特點是利用多數(shù)真核細(xì)胞中 mRNA 的3'端有 polyA 尾巴，使用oligo（dT）—纖維素親和層析法，從總RNA中分離純化出mRNA，但此方法費時費力。在 Ulrich 研究的基礎(chǔ)上，1979年 Chirgwin 等[4]發(fā)明了一種破裂細(xì)胞膜但不破壞核苷酸的方法，即先將組織在異硫氰酸胍和β-巰基乙醇中混合均勻，然后通過乙醇抽提或氯化銫梯度超速離心來分離純化細(xì)胞中的RNA。該技術(shù)是首次能特異性分離RNA 的方法，但還是存在諸多缺點，比如耗時長、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有機(jī)溶劑，操作有一定的風(fēng)險性。到目前為止，雖然在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了很多核酸提取技術(shù)，但均沒有克服耗時長、危險性大等諸多弊端。

伴隨著生物產(chǎn)業(yè)的商業(yè)化發(fā)展，很多試劑公司依此設(shè)計研制出了很多商品化試劑，如 TaKaRa 公司的DNAiso Reagent，該試劑中含高濃度的胍鹽，可從動物組織、植物材料、各種微生物、培養(yǎng)細(xì)胞中簡單、快速的提取基因組DNA，且獲得的基因組DNA純度高、完整性好。整個操作過程也不使用苯酚等毒性有機(jī)溶劑，實驗危險性小。

1.2 堿裂解法

堿裂解法是從E.coli中分離制備質(zhì)粒DNA常用的方法之一，已有30多年的發(fā)展歷史。1979年，Birnboim和Doly成功用堿性裂解液快速提取篩選重組質(zhì)粒DNA[5]。該方法基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離質(zhì)粒DNA目的。細(xì)菌懸浮液在pH12.6的堿性溶液十二烷基硫酸鈉（SDS）中，會使細(xì)胞壁破裂，蛋白質(zhì)和染色體DNA變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈在拓?fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的，彼此不會分離。當(dāng)pH恢復(fù)到中性時，變性的質(zhì)粒DNA分子迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，而蛋白質(zhì)與染色體DNA不能復(fù)性而呈絮狀沉淀。通過離心處理可除去染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA以及蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等，而質(zhì)粒DNA保存在溶液中。而且，在SDS存在的條件下，堿裂解法對E.coli的所有菌株都適用。

目前市場上的多數(shù)質(zhì)粒DNA提取試劑盒都是在此方法基礎(chǔ)上并結(jié)合柱離心法發(fā)展而來。離心柱采用特殊的硅基質(zhì)吸附材料，特點是：高鹽酸性緩沖液存在時可特異性吸附DNA，除去RNA與蛋白質(zhì)等不能結(jié)合的雜質(zhì)，而低鹽堿性緩沖液可洗脫結(jié)合在吸附柱上的DNA。試劑盒提取質(zhì)粒DNA的優(yōu)點是：DNA純度高。

1.3 CTAB裂解法

1980年，Murray和Thompson 發(fā)明了一種方法[6]：使用溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）法可快速提取高純度的大分子量植物DNA。經(jīng)液氮研磨樣品后，用適當(dāng)體積的 CTAB 緩沖液重溶樣品。CTAB是一種非離子型去垢劑，它能使核酸和酸性的多糖從低離子強(qiáng)度的溶液中沉淀出來[7]。同時，蛋白質(zhì)和中性多糖等雜質(zhì)留在溶液中。CTAB 裂解法對產(chǎn)生大量多糖的生物體的核酸提純非常有用的，如植物和某些革蘭氏陰性菌，但這種方法的缺點是：實驗步驟多，操作較繁瑣。

經(jīng)過方法改進(jìn)，可以將CTAB與其它方法相結(jié)合以快速提取高純度的動植物DNA。彭敏等[8]用貝類閉殼肌為樣品，參照Nie C等[9]的SDS-CTAB結(jié)合法，利用高濃度鹽離子和SDS除去蛋白和多糖，然后用低濃度鹽離子和CTAB進(jìn)一步純化DNA。改進(jìn)后的SDS-CTAB法提取的DNA，具有純度高，無蛋白質(zhì)和RNA污染的優(yōu)點。

1.4 酚抽提法

苯酚作為蛋白變性劑，能使蛋白質(zhì)快速變性，因此，可用來提取基因組DNA：先用 EDTA 和 SDS 為主的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，再經(jīng)蛋白酶 K 處理后，然后用pH8.0 的 Tris 飽和酚抽提DNA，重復(fù)抽提至一定純度后，根據(jù)不同需要進(jìn)行透析或沉淀處理，獲得所需的核酸DNA。酚抽提的基本原理是：苯酚處理勻漿液時，由于蛋白質(zhì)與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)，與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于有機(jī)相酚中，而DNA溶于水相。離心分層后取出水相，再利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀出核酸DNA。最早的分離方法是由 Blin 等[10]根據(jù)Gross-Bellard 等提出的原始方案改良并建立的酚抽提法。此法的優(yōu)點是提取的DNA保持天然狀態(tài)，且純度高，可滿足臨床各種檢測所需；缺點是操作繁瑣，比較費時，而且使用毒性有機(jī)溶劑苯酚對試驗人員有一定的危害。

因苯酚不能完全抑制RNase活性[11]，研究者在酚抽提法的基礎(chǔ)上又進(jìn)行了發(fā)展改進(jìn)，改用酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）混合液提取純化核酸。加入混合液離心分離后，溶液分為兩相，油相在下，水相在上。蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，糖類和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)在油相，DNA在水相中，分離出水相，加入乙醇沉淀DNA，離心獲得核酸DNA[12]。該方法獲得的核酸DNA具有更高的純度，但還是難免繁瑣的操作。

2 核酸的純化過程

若組織細(xì)胞中含較多的多糖或其它次生代謝產(chǎn)物，如酚，酯，萜等，提取高純度DNA 就相對比較困難，進(jìn)而影響后續(xù)的各種試驗分析，因此，需要對提取的核酸進(jìn)行進(jìn)一步純化處理[13]。現(xiàn)在市場上有許多商品化的核酸固相提取純化試劑盒，與常規(guī)方法相比它能快速有效的提純核酸[14]。

此方法常用的固相基質(zhì)有二氧化硅基質(zhì)，磁珠和陰離子交換介質(zhì)，四個關(guān)鍵步驟是：細(xì)胞裂解，核酸吸附，洗滌和洗脫[15]。首先加入裂解液裂解細(xì)胞；其次用特別的 pH 緩沖液調(diào)節(jié)柱子pH改變其表面或官能團(tuán)，使其成為特殊的化學(xué)形式以吸附核酸[16]；再次，用洗滌緩沖液洗滌以除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；最后，用 TE緩沖液或水洗脫柱子上的目的核酸，收集純化的核酸。通常情況下，提取過程的洗滌和洗脫步驟都需要用到快速離心，真空過濾等步驟，對儀器設(shè)備有一定的要求。

2.1 二氧化硅基質(zhì)法

二氧化硅基質(zhì)類型包括玻璃微粒，二氧化硅粒子，玻璃微纖維和硅藻土[17]。二氧化硅基質(zhì)提取的基本原理[18-19]：帶負(fù)電荷的DNA和帶正電的二氧化硅粒子有很高的親和力。陽離子Na+發(fā)揮橋梁作用，吸附核酸磷酸鹽骨架上帶負(fù)電荷的氧，在高鹽的酸性條件下，Na+打破水中的氫和二氧化硅上帶負(fù)電荷的氧離子間的氫鍵，DNA與二氧化硅緊密結(jié)合，先洗滌除去其他雜質(zhì)，再用低離子強(qiáng)度的TE緩沖液或蒸餾水洗脫結(jié)合的DNA分子。

2.2 磁珠法

磁性分離是一種簡單有效的核酸提純方法。通常，核酸提純可使用的磁性載體有：有親和力的固定配體或?qū)δ康暮怂嵊杏H和力的磁性載體。例如，不同的合成聚合物、生物聚合物和磁粉等。

磁珠表面連接了可特異地與DNA發(fā)生作用的功能基團(tuán)，具有可逆吸附DNA的特性，通常采用帶有氨基、巰基、環(huán)氧基等基團(tuán)的活化試劑對磁珠表面包覆的高分子進(jìn)行化學(xué)修飾。若裂解液提供適宜的離子強(qiáng)度、pH等條件，功能團(tuán)的數(shù)量就決定了磁珠吸附DNA的量，因此，需要將裂解液設(shè)置不同的稀釋度，摸索最佳離子強(qiáng)度、pH等條件。同時，需要制備不同濃度的DNA樣本，使最高DNA含量在磁珠吸附能力的限度范圍內(nèi)。磁珠法提純核酸最大的優(yōu)點就是自動化，以及提供的試劑可用于磁性工具，現(xiàn)在市場上可買到許多以磁珠為基礎(chǔ)的核酸提純試劑盒。而且這種試劑盒不需要任何有機(jī)溶劑，也不需要反復(fù)離心，真空過濾或柱分離等步驟，僅僅是以核酸結(jié)合磁粉為基礎(chǔ)，大大減少了試驗對工作人員的危害，以及降低了對試驗設(shè)備的特殊要求。

2.3 陰離子交換法

陰離子交換樹脂以樹脂表面帶正電荷的二乙基胺基乙基纖維素（DEAE）群和DNA骨架上帶負(fù)電荷的磷酸鹽相互作用為基礎(chǔ)。樹脂表面面積大能稠密的耦合 DEAE 群。在低鹽的堿性溶液存在的條件下，DNA可與DEAE群結(jié)合，洗滌除去樹脂上的蛋白質(zhì)和RNA雜質(zhì)，最后用高鹽的酸性溶液洗脫仍結(jié)合在樹脂上的核酸DNA。此方法能有效的從RNA和其它雜質(zhì)中分離DNA分子。其中，鹽濃度和 pH 是核酸能否很好的與柱結(jié)合或洗脫的關(guān)鍵因素。

3 核酸的一步法提取

通常，生物大分子的提取或純化技術(shù)只能從生物體中單獨提取一種類型的核酸（DNA或RNA）或蛋白質(zhì)。如需從有限的細(xì)胞或組織材料中同時提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)，則需要分別提取，顯然提取效率不高。因此，一步法應(yīng)用而生[20]。

1987年，Chomczynski 和 Sacchi 改進(jìn)單步提取法，將異硫氰酸胍和酚/氯仿（phenol-chloroform）結(jié)合起來，并在 1989 年成功注冊商標(biāo)為 TRIzol?。該方法以異硫氰酸胍在低 pH 的苯酚單相溶液中裂解細(xì)胞為基礎(chǔ)[21]。混合液中加入氯仿后離心形成三相溶液，DNA和蛋白質(zhì)在有機(jī)相和中間相，RNA在水相，通過乙醇或異丙醇沉淀有機(jī)相可分離DNA和蛋白質(zhì)，加入異丙醇從水相中沉淀RNA[22]。該方法將核酸提純步驟縮短到了一步，有諸多優(yōu)點，如縮短分離時間，增加樣品通量，擴(kuò)大了樣品選擇范圍，允許研究人員從更少量樣品中純化RNA。盡管優(yōu)化了純化步驟，但這種方法仍然有一些局限，比如，超速離心對設(shè)備的特殊要求，超速離心后也經(jīng)常導(dǎo)致RNA凝集，形成球塊，不利于懸浮，且粗糙的有機(jī)溶劑會引起樣品中RNA斷裂等等。

一體化提取還有很多商品化的試劑盒。諸如以吸附柱為基礎(chǔ)的提取試劑盒，可以從同一生物樣品中同時提純基因組DNA、總RNA和總蛋白質(zhì)，且用乙醇沉淀，不使用苯酚或氯仿等毒性有機(jī)溶劑。此類試劑盒適合于從少量的各種細(xì)胞培養(yǎng)物、動物及人類自身的組織中同時提取DNA、RNA和蛋白質(zhì)。商品化的自動化提取系統(tǒng)是為處理大批量試驗樣品而設(shè)計的，該系統(tǒng)借助自動化儀器簡化核酸提取步驟，可節(jié)省工作時間，降低人工成本，提高操作者自身安全，而且能增加結(jié)果的再現(xiàn)性[23]。

4 展望

對動植物樣品的分子生物學(xué)分析，就必須送達(dá)實驗室進(jìn)行，非常不便。諸如血液等臨床樣品，需要冷藏運輸?shù)綄嶒炇遥荒軡M足就地、快速確診的需求。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）、核酸層析試紙條等現(xiàn)場核酸檢測技術(shù)應(yīng)運而生，并得到廣大科研及檢測人員的青睞，但是便攜、現(xiàn)場化的核酸提取技術(shù)相對匱乏。同時，考慮到商品化核酸自動化提取儀是在一個相對狹小的空間內(nèi)進(jìn)行多個樣品的同步操作，存在樣品間交叉污染的風(fēng)險。因此，在壓縮體積實現(xiàn)儀器便攜化的同時，優(yōu)化樣品處理流程，增加防止核酸相互污染的裝置，也是研究者將來需要重點考慮的問題。

總之，自動化技術(shù)的迅速發(fā)展帶動了核酸自動化提取系統(tǒng)的發(fā)展。但目前自動化提取系統(tǒng)存在的諸多問題也是顯而易見的。為了滿足科研及實際檢測工作需要，將來的預(yù)期是發(fā)明一種一體化的生物分子提取系統(tǒng)或一個微型便攜的提取系統(tǒng)。

[1] 周麗，李飛，魏剛.動物DNA提取方法概述[J].畜牧與獸醫(yī)，2008，40（3）：66-68.

[2] Dahm R.Friedrich Miescher and the Discovery of DNA[M/OL].The Netherlands：Amsterdam，2004.http：//www.elsevier.com.

[3] Ullrich A，Shine J，Chirgwin J.Rat insulin genes：construction of plasmids containing the coding sequences[J].science，1977，196（4296）：1313-1319.

[4] Chirgwin J M，Przybyla A E，MacDonal R J，et al. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease [J].Biochemistry，1979，18（24）：5294-5299.

[5] Birnboim H C，Doly J.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinan plasmid DNA [J]. Nucleic acids research，1979，7（6）：1513–1523.

[6] Murray M G，Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J]. Nucleic acids research，1980，8（19）：4321-4325.

[7] Sambrook J，Russel D.Molecular Cloning：A Laboratory Manual[M]. 3rd ed. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001.

[8] 彭敏，蔣偉明，陳秀荔，等. 一種提取高質(zhì)量貝類基因組DNA的簡易方法 [J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2010，30（6）：78-81.

[9] Nie C，Kebede H，Auld D L，et al. A safe inexpensive method to isolate high quality plant and fungal DNA in an open laboratory environment [J].African Journal of Biotechnology，2008，7（16）：2818-2822.

[10] Blin N，Stafford D W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes [J]. Nucleic acids research， 1976，3（9）：2303-2308.

[11] J·薩姆布魯克，D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南 [M].黃培堂，王嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.3版.北京：科學(xué)出版社，2002.

[12] Chomczynski P，Sacchi N.The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform extraction ： twenty-something years on [J]. Nature Protocols，2006，1（2）：581-585.

[13] 李樹清，徐紅，陳志飛.鹿流行性出血熱病毒核酸的提純[J]. 中國動物檢疫，1996，13（2）：11-12.

[14] Esser K H，Marx W H，Lisowsky T. Nucleic acidfree matrix： regeneration of DNA binding columns[J].Bio Techniques， 2005，39（2）：270-271.

[15] Kojima K，Ozawa S. Method for isolating and purifying nucleic acids：United State，20110224419A1[P].2011-09-15.

[16] Gjerse D T，Hoang L，Hornby D.RNA Purification and Analysis：Sample Preparation，Extraction，Chromatography [M].Germany：Wiley-VCH，2009.

[17] Padhye V V，York C，Burkiewiez A. Nucleic acid purification on silica gel and glass mixture：United States，5658548[P].1997-08-19.

[18] Woodard D L，Howard A J， Down J A. Process for purifying DNA on hydrated silica：United State，5342931[P].1994-08-30.

[19] Esser K H，Marx W H， Lisowsky T. MaxXbond：first regeneration system for DNA binding silica matrices [J]. Nature Methods，2006，3（1）：1-2.

[20] 孫映雪，孫承英，趙永剛，等.兩種一步法RNA提取試劑的比較[J].中國動物檢疫，2004，22（12）：22-24.

[21] Bowtell D D.Rapid isolation of eukaryotic DNA [J].Analytical biochemistry， 1987，162（2）：463-465.

[22] Smarason S V，Smith A V. Method for desalting nucleic acids：United State，6897027[P].2005-05-24.

[23] Boyd J. Robotic laboratory automation [J]. Science， 2002，295（5554）：517-518.