王棕可 胡躍強

1廣西中醫(yī)學(xué)院（廣西南寧530001）

2廣西中醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院（廣西南寧530023）

Koizumi［1］和 Longa［2］創(chuàng)立的線栓法局灶性腦缺血再灌注模型是目前研究局灶性腦缺血及再灌注損傷的理想模型，是通過阻斷大腦中動脈的血流，并可拔出線栓實現(xiàn)再灌注，但因線栓的缺陷，其成功率有待提高。現(xiàn)通過分類對比的方法，將傳統(tǒng)與現(xiàn)今模型制作特點總結(jié)如下。

1 實驗材料

1.1 模型大鼠的選擇（1）動物品系。SD和wistar兩種大鼠在腦缺血后的梗死體積有所不同。Markgmf等［3］用光化學(xué)法腦缺血模型比較了這兩種大鼠的梗死情況：SD大鼠可見較恒定的頂顆皮質(zhì)梗死灶，梗死體積大于wistar大鼠，變異較小，周邊可見不完全性壞死區(qū)，即半暗帶，占總梗死面積的91%。wistar大鼠梗死灶較小，但變異較多，不完全壞死區(qū)占總損傷區(qū)的30.1%。因此對于腦缺血模型選擇SD大鼠優(yōu)于wistar大鼠。同一種大鼠在體質(zhì)量恒定的情況下，如果批次、來源不同，大鼠的生理狀況會有變異。例如，頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）的直徑、頸靜脈孔的大小會有不同。相應(yīng)地在制備線栓的時候就需要調(diào)整，入線深度也需要調(diào)整。（2）體質(zhì)量和鼠齡。目前多主張選用體質(zhì)量280～350g的大鼠。隨鼠齡增加，體質(zhì)量相應(yīng)增加，動脈直徑、頸靜脈孔直徑也會增加，體質(zhì)量過大，顱內(nèi)血管增粗，難以完全阻斷；體質(zhì)量過輕，則難以將線栓插入足夠深度。

1.2 線栓制備目前常用制備線栓的材料有尼龍繩和魚線。傳統(tǒng)尼龍繩的栓頭用灼燒的方法制作，但灼燒后栓頭表面光滑不一，易毛刺、倒鉤。 楊雪榮等［4］取直徑 0.2～0.25mm 的尼龍線，剪成長60mm的栓線，加熱使一端成光滑球面，直徑約0.26～0.3mm，在顯微鏡下觀察其光滑程度，不合格削除。但該方法很難掌握灼燒的火候，線頭常常太大不易進入血管并且該直徑相對于上面提到的大鼠顯得太粗。有人提出使用石蠟或硅膠制作栓頭。這兩種方法較灼燒易控制栓頭的大小。蔣祝昌等［5］對石蠟線栓與硅膠線栓進行比較，認(rèn)為石蠟制作的線栓使模型的成功率明顯提高，線栓從ECA進入并結(jié)扎翼腭動脈（PPA）的方法出血量少，灌洗效果好，可靠。另一種常用材料是魚線。魚線其韌性比較合適插線。魚線的柔韌性有利于實驗中隨時改變線栓進入的角度與形狀，在保證速度的同時也保證了阻斷大腦中動脈的幾率。

2 手術(shù)的操作

2.1 切口與線栓走向的選擇線栓走向的傳統(tǒng)方式是將線栓由頸外動脈插入經(jīng)頸總動脈（CCA）分叉處入頸內(nèi)動脈（ICA）進而前行阻斷大腦中動脈，并結(jié)扎翼腭動脈（PPA）。不結(jié)扎PPA，線栓易插入PPA內(nèi)，血液從頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段大量返流出；若線栓插入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段，血液會從PPA中流出，亦會導(dǎo)致大量出血，出血常發(fā)生在線栓插入后至結(jié)扎固定線栓時間段。操作不熟練時，也極費時。有學(xué)者［6］認(rèn)為PPA的結(jié)扎與否并不影響梗死體積和神經(jīng)缺損體征，即PPA并非是基底節(jié)區(qū)側(cè)支循環(huán)的主要供應(yīng)血管。大量實驗證明，在熟練并不接扎翼腭動脈情況下，只要使栓線有一定程度的彎曲，且保證栓線向屋頂方向彎曲，一般都能將線插如顱內(nèi)，決不會進入PPA。傳統(tǒng)切口的位置選擇是在頸外動脈上用眼科剪剪一小口，將線栓由頸外動脈破口處插入，實驗證明，在動脈上剪口不易控制大小，邊緣銳利，提拉時容易斷開。經(jīng)ECA插線還有2個不足［7］，一是剪斷ECA對實驗動物的損傷太大，若不剪斷，游離ECA，該動脈與ICA之間的角度太?。郏?8.25±1.37）°］，線栓不易進入 ICA，而且 ECA 比較細(xì)，眼科剪很難把握，易把動脈剪斷及不能有效控制出血量，再灌注取出栓線時由于心臟壓力較大，較容易造成腦內(nèi)出血導(dǎo)致動物死亡；二是經(jīng)此處插線，到達(dá)大腦中動脈的距離較長，相應(yīng)的線栓較長，操作時間較長。國內(nèi)一些學(xué)者［8］經(jīng)改良后采用在ICA、ECA分叉處栓線，即在CCA末端剪一小口，將線插入。研究發(fā)現(xiàn)CCA末端附近有頸動脈竇和頸動脈小球。這種方法操作不慎，容易引起實驗動物血壓升高和呼吸異常。吳松笛等［9］發(fā)現(xiàn)從頸總動脈插入的方法，難度比從頸外動脈插入要小，手術(shù)更易施行，且不刺激氣管，不分離頸內(nèi)動脈，對血管的機械刺激限制在頸總動脈，對生理結(jié)構(gòu)的損傷小。顯微鏡直視下可清晰看見藍(lán)色線栓從分叉處進入頸內(nèi)動脈，常規(guī)麻醉后再拔出線栓，可以防止大鼠掙扎導(dǎo)致頸內(nèi)動脈、Willis環(huán)破裂繼發(fā)蛛網(wǎng)膜下腔出血［10-11］。國內(nèi)學(xué)者［12］結(jié)合上述切口位置特點，改良了從頸總動脈插入的線栓法，在實驗中以頭皮針穿刺動脈的方式導(dǎo)入線栓，操作更簡便，成功率更高。

2.2 栓塞的深度與栓塞時間栓線深度過深會導(dǎo)致動物死亡，不足又無法造模成功，因此栓線深度至關(guān)重要。一般認(rèn)為從ECA 或 CCA 分叉處插入，其深度為（18±0.5）mm；曹勇軍等［13］在實驗中測量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCA插入的栓線長度為（23±0.5）mm比較適宜，而經(jīng)ECA插入的栓線長度為（20±0.5）mm比較適宜。因為大鼠的體質(zhì)量與血管MCA長度呈正相關(guān)，并且大鼠的體質(zhì)量與栓線直徑之間有正交互作用，因此栓線的長度、直徑要與大鼠的體質(zhì)量相匹配。在對理想栓線探討的實驗中，關(guān)云謙等［14］發(fā)現(xiàn)：進入ICA的尼龍線深度超過18～19mm可致使顱內(nèi)Willis環(huán)的血管被尼龍線刺破而形成蛛網(wǎng)膜下腔出血。辛世萌等［15］報道的最佳方案為：大鼠體質(zhì)量 250～330g、線長17mm或 18mm，栓線直徑0.28mm。該方案制作的MCAO模型成功率高、重復(fù)性好、生理指標(biāo)影響小，并且發(fā)現(xiàn)栓線插入長度17mm或18mm對造模效果的影響沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異。綜合不同的研究結(jié)果，對于體質(zhì)量適宜造模的大鼠，理想的栓線長度為17～18mm；在栓線深度上用有色筆在栓線的20mm處做標(biāo)記，直到把有顏色的標(biāo)記送入分叉處，才能保證栓線深度，這時感覺有阻力時即停止插入，并向外稍拉出少許即可。

2.3 術(shù)后存活狀況和死亡原因據(jù)實驗觀察，腦缺血2h后，大鼠可以存活7～14d，甚至更長時間。術(shù)后24h大鼠神經(jīng)功能受損癥狀即有好轉(zhuǎn)，存活更長時間的大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀會有不同程度地恢復(fù)。7d時，大鼠活潑性有明顯改善，此時即使原來神經(jīng)功能缺損程度評分很高的大鼠也不能繼續(xù)觀察到原地旋轉(zhuǎn)。一般來講，手術(shù)后大鼠存活期可以滿足通常的實驗需求，但是，隨著栓塞和再灌注損傷時間的延長，死亡率會上升。隨著存活時間延長，大鼠的體質(zhì)量持續(xù)下降，缺血4周的大鼠大腦可見明顯萎縮［16］。 研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在術(shù)后 24～48h 最容易死亡［17-18］，是嚴(yán)重腦缺血損傷造成的，直接因素是腦水腫。 Abe［19］和 Koizumi［1］的實驗可見，梗死3、6h，腦水分由79.8%分別升到81.6%和83.9%；梗死3h再灌注3h則上升到86.4%（干重/濕重法），梗死周圍區(qū)，即大腦前動脈供血區(qū)水分也明顯升高。另外，尼龍線刺破顱內(nèi)血管也能導(dǎo)致動物術(shù)后早期死亡，這種情況多見于術(shù)中。因線頭入顱困難，推進時用力過猛；或者由于尼龍線頭端銳利，進入ICA的深度超過18～19mm，致使顱內(nèi)Willis環(huán)的血管被尼龍線刺破而形成蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）此時，血凝塊廣泛地凝結(jié)在軟腦膜毛細(xì)血管表面，影響腦微循環(huán)；血管壁的損害會影響到血管周圍腎上腺素能神經(jīng)纖維，進而影響血管的正常舒縮功能，這些受影響的血管還容易發(fā)生痙攣并加重?fù)p傷。SAH大鼠常表現(xiàn)為呼吸道分泌物增多，呼吸困難。術(shù)后損傷較重的大鼠，神經(jīng)功能缺損癥狀分級高［2，20］，腦水腫也較重［21］。 最終多在 24h 內(nèi)死亡。

3 結(jié) 語

建立反應(yīng)一致、重復(fù)性好的缺血動物模型是研究缺血性腦損傷發(fā)生機制及研究干預(yù)效果的重要步驟。由以上比較可見，線栓法制備腦缺血模型的成功關(guān)鍵在于控制大鼠的體質(zhì)量和鼠齡，線栓插入ICA的深度要足夠到達(dá)大腦中動脈，而且線栓直徑要達(dá)到一定的要求。控制好易變因素，可避免實驗結(jié)果的不穩(wěn)定性。

線栓造模也并非完美無缺，存在著下列不足：線栓造模過程是非直觀的手術(shù)，血流是否完全阻斷不能即刻得知。動物品系、體質(zhì)量、批次會影響結(jié)果。動物飼養(yǎng)條件好的單位所繁育的動物，可以使影響程度降低。實驗者的造模技術(shù)訓(xùn)練影響結(jié)果。嚴(yán)格的訓(xùn)練和足夠例數(shù)的實踐可以復(fù)制出穩(wěn)定的結(jié)果，不同的操作者之間的誤差較大。操作不小心極易刺破血管或拔線栓時引起出血，輕柔、精細(xì)的操作可以減少血管破裂的發(fā)生。傳統(tǒng)的線栓法不利于新模型制備，如：腦缺血大鼠預(yù)處理再灌注模型，此模型需反復(fù)短時間大腦中動脈梗死，傳統(tǒng)尼龍繩不利于反復(fù)缺血操作。

目前缺血預(yù)處理已成為新的腦缺血研究熱點。成熟的造模方法必定有助于研究的發(fā)展。結(jié)合傳統(tǒng)與現(xiàn)今的造模方法利弊，筆者推測：選擇體質(zhì)量250～300g大鼠，采用頭皮針介導(dǎo)，在距離CCA分叉處0.5mm插入魚線線栓 （栓線直徑0.28mm），進入IEA 18mm的方法，是具有易操作、成功率高，可反復(fù)進行缺血處理的造模方法，適合現(xiàn)今腦血缺血模型要求的制備方向。

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