李樹峰 王正敏 李雯

·基礎研究·

用于神經突導向研究的螺旋神經元培養(yǎng)體系初步觀察△

李樹峰 王正敏 李雯＊

目的探尋適用于螺旋神經元神經突導向研究的螺旋神經元培養(yǎng)體系。方法取新生SD大鼠的螺旋神經節(jié)，分別進行分離培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)，比較神經突的生長模式。組織塊培養(yǎng)時，采用不同底物(包括多聚賴氨酸、層粘連蛋白和I型膠原蛋白等)鋪片，觀察對螺旋神經元組織塊貼壁和神經突生長的影響。用微管相關蛋白2(MAP2)抗體和微管聚合蛋白1(Tau-1)抗體鑒別神經突的極性。結果組織塊培養(yǎng)體系中，部分神經突長出細胞毯，在無干擾的環(huán)境中生長。以多聚賴氨酸加層粘連蛋白為底物鋪片時，組織塊貼壁率高，神經突數量多、生長較快，有利于獲取更多適于神經突導向研究的神經突。培養(yǎng)體系中的神經突可被Tau-1抗體標記，而不能被MAP2抗體標記。結論在多聚賴氨酸加層粘連蛋白包被的可移動玻片上，進行螺旋神經元組織塊培養(yǎng)獲取自由神經突的方法適合螺旋神經元神經突的導向研究。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：82-85)

螺旋神經元；神經突導向；神經突；組織塊培養(yǎng)；多聚賴氨酸；層粘連蛋白

螺旋神經元是一種將Corti器轉換產生的電信號向中樞傳遞的雙極神經元，也是人工耳蝸植入后將言語處理器轉換編程的電信號向大腦傳遞的關鍵途徑。重度和極重度感音神經性聾往往有原發(fā)或繼發(fā)的螺旋神經元退行性變，包括螺旋神經元數量減少及周圍突退縮和減少等[1-3]，從而影響人工耳蝸植入后的效果[4-6]。多種因素可促進螺旋神經元神經突的再生，然而體內實驗研究表明，神經突的再生方向是無序的，并非總是朝鼓階和基底膜方向[7]。神經突的導向研究不僅需要單離的神經突，而且由于神經突與導向因子來源之間的方位可以任意調整，還需有活細胞長時間觀察和記錄裝置。關于螺旋神經元神經突導向的相關研究雖有少量報道，然而均沒有建立能滿足上述要求的培養(yǎng)體系[8-11]。為探尋這樣一種培養(yǎng)體系，本研究比較了分離培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)時螺旋神經元神經突的不同生長模式，以及不同培養(yǎng)底物對組織塊培養(yǎng)的螺旋神經元神經突生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 分別采取組織塊培養(yǎng)和分離培養(yǎng)兩種方法培養(yǎng)螺旋神經元，觀察螺旋神經元神經突的生長模式；觀察采用不同底物進行組織塊培養(yǎng)對組織塊貼壁和神經突生長情況的影響。實驗采取成組設計。

培養(yǎng)玻片的包被：直徑14 mm的圓形玻片經酸洗，然后以蒸餾水和無水乙醇先后漂洗，再經干熱滅菌后備用。底物包被在超凈臺中進行，分為以下5組：①層粘連蛋白組(L組)：20 μg/mL層粘連蛋白(L2020， Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于37 ℃溫箱中2 h后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)漂洗3次，然后置超凈臺中晾干備用； ②多聚賴氨酸組(P組)：100 μg/mL多聚賴氨酸(P7405，Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于4 ℃冰箱中過夜后，用PBS漂洗3次，然后置超凈臺中晾干備用；③多聚賴氨酸加層粘連蛋白組(P+L組)：玻片先用多聚賴氨酸后，用層粘連蛋白按上述方法處理；④I型膠原蛋白組(C組)：300 μg/mL I型膠原蛋白(C3867，Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于4 ℃冰箱中過夜后，用PBS漂洗3次，然后超凈臺中晾干備用； ⑤I型膠原蛋白加層粘連蛋白組(C+L組)：玻片先用I型膠原蛋白后，用層粘連蛋白按上述方法處理。

1.2 螺旋神經節(jié)的解剖 將出生4～6 d的新生SD大鼠斷頭后取出顳骨，置于0～4 ℃的PBS中。打開耳囊，去除血管紋、基底膜、蝸神經和蝸軸骨質，將剩余的蝸軸剪成300～400 μm的組織塊。

1.3 螺旋神經元的培養(yǎng) ①組織塊培養(yǎng)：培養(yǎng)液為DMEM/F12(10565018，Invitrogen，美國)加B27和N2添加劑(17504-044，17502-048，Invitrogen，美國)。將3塊螺旋神經節(jié)組織塊分別移放于培養(yǎng)皿中的玻片上，加入培養(yǎng)液至剛沒過組織塊，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待其貼壁后再添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。上述不同培養(yǎng)底物組中，每組10個玻片，每片3個組織塊，共30個組織塊。分別計數貼壁生長的組織塊數量。②分離培養(yǎng)：螺旋神經節(jié)組織塊在37 ℃的0.25%胰蛋白酶消化30 h，吹打數下至組織塊分散。加入胎牛血清至含量10%，靜置10 min終止消化。取上層細胞混懸液離心(4 ℃、200×g、3 min)。棄上清液，加入培養(yǎng)液重懸、混勻，約每6個蝸軸加1.5 mL培養(yǎng)液。細胞懸液接種于培養(yǎng)皿內多聚賴氨酸加層粘連蛋白包被的玻片上，密度為200 μL/cm2，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h待貼壁，而后添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 螺旋神經元及其神經突的免疫熒光鑒定 培養(yǎng)玻片用PBS漂洗后，用-10～-20 ℃的甲醇固定15 min。PBS漂洗后，用1%山羊血清封閉30 min。再用神經絲蛋白(neurofilament，NF)抗體(1∶500，200 kD，N4142，Sigma-Aldrich，美國)室溫下作用1 h，PBS漂洗后用Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶800，Molecular Probes，A-11008)作用1 h。PBS漂洗后再先后用膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(1∶200，G6171，Sigma-Aldrich，美國)和Alexa Fluor 555熒光二抗(1∶500，Molecular Probes，A-21422)作用1 h。最后用4′,6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(C1002，Beyotime，美國)作用1 h，以顯示細胞核。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察，計數組織塊中的神經突總數和已長出組織塊周邊細胞毯的神經突數量。用AxioVision 4.6.3軟件測量神經突長度。

為區(qū)分神經突極性，用微管相關蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗體和微管聚合蛋白(Tau-1)抗體分別標記螺旋神經元周圍突和中樞突。培養(yǎng)組織塊按上述方法經固定、封閉后，先后用Tau-1抗體(1∶500，MAB3420，Millipore，美國)和IgG-TRITC熒光二抗(1∶200，T5393，Sigma-Aldrich，美國)分別在室溫下作用1 h。再先后用MAP2抗體(1∶800，Abcam,Cambridge，ab11267，英國)和Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶800) 分別在室溫下作用1 h。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計學軟件，具體方法包括χ2檢驗和方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 培養(yǎng)方法對神經突生長的影響 在螺旋神經元的組織塊培養(yǎng)和分離培養(yǎng)體系中，主要有螺旋神經元、成纖維細胞和神經膜細胞(雪旺細胞)。螺旋神經元通常有2個或2個以上細長突起，即神經突；神經膜細胞一般也有長突起形成。但是，螺旋神經元的神經突較細且粗細均一，有曲張體和生長錐等特征性結構；而神經膜細胞的神經突較粗，在胞體的起始部位突起有明顯由粗變細的特征。成纖維細胞通常有不規(guī)則的胞體，有時也有較短的突起。在分離培養(yǎng)體系中，上述突起往往混雜在一起，或者被細胞體遮蓋，在相差顯微鏡下難以辨別(附3頁圖1)。在組織塊培養(yǎng)體系中，大部分神經突也生長在組織塊周圍的細胞毯中，難以在相差顯微鏡下辨認。但是有少部分神經突進入細胞毯外的“潔凈”環(huán)境中生長，稱為“自由神經突”[12]。這時，在神經突的生長方向及其周圍沒有其他細胞和突起的干擾，而且在相差顯微鏡下依據其上的曲張體和生長錐等結構特點即可辨認。在這些“自由神經突”的胞體端，通常有神經膜細胞伴隨生長(附3頁圖2)。

2.2 培養(yǎng)底物對神經突生長的影響 ①采用不同底物進行螺旋神經元的組織塊培養(yǎng)時，組織塊的貼壁情況各不相同(附3頁圖3)。組織塊貼壁比率分別為：L組60.0%(18/30)、 P組83.3%(25/30)、P+L組86.7%(26/30)、C+L組100%(30/30)和 C組93.3%(28/30)，經χ2檢驗，P組、P+L組、C組、C+L組各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P值均gt;0.05)，上述各組與L組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P值均lt;0.05)。②各組織塊長出的神經突平均數量分別為：L組8.7(156/18)、P組7.9(197/25)、P+L組7.8(203/26)、C+L組2.2(65/30)和C組1.1(30/28)，P組、L組和P+L組各組與C組、C+L組各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均lt;0.05)。③各組織塊長出的“自由神經突”的平均數量分別為：L組0.56(10/18)、P組0.44(11/25)、P+L組0.65(17/26)、C+L組0.07(2/30)和C組0(0/28)，P組、L組和P+L組各組與C組、C+L組各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均lt;0.05)。④“自由神經突”的平均長度分別為：L組(760.21±43.11)μm、P組(553.95±32.79)μm、P+L組(829.57±55.39)μm，L組和P+L組兩組與P組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P值均lt;0.05)，L組與P+L組間差異無統(tǒng)計學意義。除標明的之外，上述各組間比較均采用方差分析。

2.3 “自由神經突” 培養(yǎng)有“自由神經突”的圓形小玻片可用小鑷子移入活細胞長時間觀察系統(tǒng)中的培養(yǎng)裝置內。玻片的方位可以任意調整，以使神經突與產生或釋放神經突導向信號的裝置(如電極或毛細玻璃管等)之間形成特定的方位，利于神經突的導向研究。培養(yǎng)有“自由神經突”的玻片移入螺旋神經元神經突電場導向研究系統(tǒng)中，后者由自動定時拍攝的倒置相差顯微鏡和帶有溫度和CO2控制活細胞的培養(yǎng)觀察裝置以及安裝電極并連接電流發(fā)生裝置的培養(yǎng)皿組成[12]?？捎眉氠樥{整玻片的方位，使神經突末端方位與電場方向之間形成特定角度，觀察神經突在不同電場作用下的生長偏向性。

2.4 神經突的極性 組織塊培養(yǎng)體系中的神經突包括“自由神經突”可被Tau-1抗體標記，而不能被MAP2抗體標記。成纖維細胞和神經膜細胞的胞體和突起均不能被兩者標記(附4頁圖4)。

3 討論

3.1 培養(yǎng)方法對神經突生長的影響 分離培養(yǎng)是通常采用的培養(yǎng)體系，如雞胚背根神經節(jié)細胞和非洲爪蟾胚胎脊髓神經元的分離培養(yǎng)等[13-15]。神經突的導向研究需要單離的神經突，其生長延伸應處于無其他細胞和物質阻擋和干擾的潔凈環(huán)境；同時還應有足夠的空間在神經突周圍放置釋放導向因素的裝置，如微電極和毛細玻璃管等。然而分離培養(yǎng)的螺旋神經元培養(yǎng)體系中，螺旋神經元的神經突與神經膜細胞和成纖維細胞混雜在一起，在相差顯微鏡下無法辨認；而且神經突的周圍和延伸方向上的細胞成分將對神經突的延伸形成干擾，因而影響導向因素作用的分析。在以往關于螺旋神經元神經突生長的相關研究中，更常采用組織塊培養(yǎng)的方法[8-11]。在這些研究中，采用微圖形化導向因子研究對培養(yǎng)在其上神經突的導向作用，即將不可溶的導向因子包被在培養(yǎng)底物上，使之成邊界、條帶或斑塊的微圖形?？扇苄缘膶蛞蜃觿t以離散的液體濃度或由固定位置細胞釋放的形式研究其導向作用。然而，由于神經突由胞體發(fā)出的部位是不可預知的、不均勻的，也是無法確定的，因而難以準確判斷分析神經突生長的偏轉情況，影響神經突導向研究的精確性和效率。此外，神經突導向研究中普遍應用的必要工具——活細胞長時間觀察記錄裝置，在這些研究中沒有采用，因而難以確定神經突的生長過程中是否受到干擾或阻礙。

在作者的前期研究中已證實，采用組織塊培養(yǎng)獲取的“自由神經突”可在相差顯微鏡下依據形態(tài)進行辨認；培養(yǎng)于可移動玻片上的“自由神經突”可針對導向因子釋放裝置任意調整方位[12]。這種可移動玻片上的神經突不僅適合螺旋神經元的神經突導向研究，也有助于其他神經元的神經突導向研究。

3.2 不同培養(yǎng)底物對神經突生長的影響 本研究比較了3種常用的細胞培養(yǎng)底物對螺旋神經元組織塊貼壁和神經突生長的影響，結果表明，培養(yǎng)底物不僅影響組織塊的貼壁，而且影響神經突的生長。近幾年，I型膠原蛋白廣泛應用于神經細胞三維培養(yǎng)體系的構建[16-18]。在本研究中，使用I型膠原蛋白或I型膠原蛋白加層粘連蛋白作為底物時，螺旋神經元的組織塊更容易貼壁。但是，神經突的長出數量和生長速度均較差，這表明I型膠原蛋白不適合作為底物培養(yǎng)螺旋神經元。多聚賴氨酸和層粘連蛋白是常用的細胞培養(yǎng)底物。以往研究表明，層粘連蛋白作為培養(yǎng)底物能促進螺旋神經元神經突的生長，而且隨著包被濃度的增加，神經突的數量和長度逐漸增加[19]。單純層粘連蛋白作為底物時，組織塊的貼壁率較低，但“自由神經突”的數量和神經突的生長情況能夠滿足神經突導向研究的需要。相反，多聚賴氨酸作為底物時，“自由神經突”的數量較少，神經突的生長速度較慢，但組織塊的貼壁率較高。而預先包被多聚賴氨酸，再包被層粘連蛋白可以增加組織塊的貼壁率，同時又能獲得較多生長良好的“自由神經突”，是適合神經突導向研究的螺旋神經元培養(yǎng)底物。

3.3 神經突的極性 為確定本研究中組織塊培養(yǎng)體系中神經突的極性，我們使用MAP2抗體和Tau-1抗體來進行免疫熒光標記，結果神經突可被Tau-1標記而不能被MAP2標記。然而這并不能完全斷定本研究中的神經突為軸突。MAP2抗體和Tau-1抗體分別是廣泛使用的樹突和軸突標記物，是目前鑒別神經突極性的通用標記物。有研究表明，在雞體內的前庭耳蝸神經中，MAP2抗體能夠標記胞體和周圍突，而不能標記中樞突；然而在分離培養(yǎng)體系中(如培養(yǎng)的背根神經節(jié))，MAP2抗體能夠標記的只有神經突的起始部分和胞體[20-21]。在體內，Tau-1 抗體只能標記神經元軸突，而不能標記胞體和樹突以及其他種類的細胞[22]。然而體外培養(yǎng)的海馬神經元的軸突、胞體和樹突都能夠被Tau-1抗體標記[23]。這些研究表明，體外培養(yǎng)神經元的神經突與體內的神經突不同，能夠被Tau-1標記，而不能被MAP2標記，可能是極性沒有發(fā)育成熟的神經突。其他研究也表明，體外培養(yǎng)神經元的神經突可發(fā)育成樹突，也可發(fā)育成軸突，成熟和發(fā)育中的神經元樹突也能夠轉化為軸突[24]。因而，本研究中神經突可能也是極性未發(fā)育成熟的神經突。

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2011-01-05)

(本文編輯 楊美琴)

Neuritesofspiralganglionneuronssuitingforneuriteguidanceinvestigationinvitro

LIShu-feng,WANGZheng-min,LIWen＊.DepartmentofOtolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：WANG Zheng-min,Email:fjswzm@gmail.com

ObjectiveTo investigate a method of cell culture suiting for neurite guidance research of spiral ganglion neurons.MethodsThe authors explored the extension and development of spiral ganglion neurites from neonatal Sprague-Dawley rats by either explant culture or disassociated culture.In addition,the impact of different substratums(including poly-D-lysine,laminin and collagen I) on neurite extension was studied.To differentiate dendrites and axons,immunofluorescence for microtubule associated protein 2(MAP2) and Tau-1 was observed.ResultsThere were a few neurites that grew out of the cell blanket to a clean area in the explant culture of spiral ganglion neurons on movable slides.The direction of neurite extension appeared random because there was no interference from other cells,which was a characteristic suiting for the investigation of neurite guidance.Explants on poly-D-lysine plus laminin had relatively higher adhesion ratio,more and longer “free” neuritis than explants on other substratum.The neurites in the spiral ganglion explants could be labeled by anti-Tau-1 but not anti-MAP2.ConclusionsIncubating free neurites on poly-D-lysine plus laminin-coated movable slides was suitable for neurite guidance research of spiral ganglion neuronsinvitro.The polarity of neurites in explant culture system was immature.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:82-85)

Spiral ganglion neuron; Axon guidance; Neurite; Explant culture; Poly-D-lysine; Laminin

上海市衛(wèi)生局青年科研項目資助(2008Y100)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科

＊實驗中心上海 200031

王正敏(Email:fjswzm@gmail.com)