鄭 喆

(遼寧省沈陽市第四人民醫(yī)院血液內(nèi)科，遼寧 沈陽 110031)

1 病例與方法

1.1 病例來源

2004年4月至2010年8月在沈陽市第四人民醫(yī)院內(nèi)科血液系門診就診、住院的急性淋巴細胞白血?。ˋLL）患者40例，其中：男26例，女14例，中位年齡：25歲。對所有患者均按FAB分型診斷標準進行確診。并以確診為缺鐵性貧血25例、巨幼細胞性貧血15例，作為對照組患者40例，其中男21例，女19例，中位年齡39歲。

1.2 分組

根據(jù)急性淋巴細胞白血病患者就診時的血Rt，WBC計數(shù)是否高于20×109/L來分組：①高白細胞組：WBC＞20×109/L，有24例；②低細胞組：WBC＜20×109/L，有16例。③對照組：確診為單純性貧血的患者，無WBC計數(shù)升高或降低，共40例。按急性淋巴細胞白血病的就診狀態(tài)來分組：初診組5例，完全緩解組6例，復發(fā)組29例。

1.3 檢測方法

1.3.1 測定p16蛋白表達值

對40例急性淋巴細胞白血病患者做骨穿，采集其少許骨髓樣本。采用APAAP方法檢測：用淋巴細胞分離液分離出單個的淋巴細胞，用1640液洗滌，制成細胞懸液，滴片后放入-20℃的冰箱里保存，備用。（對40例確診為單純性貧血的患者做骨穿時另外留取少許骨髓樣本，也做這個測定，作為對照組）。用博士德生物制品公司生產(chǎn)的免疫組化試劑盒來做免疫組化檢測，記錄結果。

1.3.2 p16蛋白表達是否缺失的檢測標準

當受檢淋巴細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的棕色顆粒，即：該棕色顆粒占細胞內(nèi)所有顆粒的25%以上時，則為陽性表達——不缺失，（正常）。當受檢淋巴細胞內(nèi)的棕色顆粒較少，即：棕色顆粒占細胞內(nèi)所有顆粒的25%以下時，則為陰性表達——低表達；表達缺失，（異常）。

1.4 統(tǒng)計學處理

1.5 研究設計類型

該調(diào)查設計屬于回顧性調(diào)查研究類型；實驗設計屬于成組設計類型。

2 結 果

2.1 對照組和ALL不同病期患者的p16蛋白表達缺失值不同

①對照組：單純性貧血者40例，他們的p16蛋白表達值，均為陽性表達；②急性淋巴細胞白血?。ˋLL）不同病期患者組40例患者的p16蛋白表達值，均為陰性表達，其中，初診組患者的p16蛋白表達缺失值為10%～21%，復發(fā)組患者的p16蛋白表達缺失值為2%～5%，完全緩解組患者的該值為19%～25%，并且，ALL初診組、復發(fā)組的p16蛋白表達缺失值顯著低于對照組、完全緩解組的p16蛋白表達缺失值，（P＜0.01）；ALL完全緩解組的p16蛋白表達值與對照組的陽性表達值的差異無顯著性（P＞0.05）。

2.2 動態(tài)檢測15例ALL患者的p16蛋白表達缺失值

檢測、觀察15例ALL患者從緩解期到復發(fā)期的演變過程中的p16蛋白表達缺失值的變化，發(fā)現(xiàn)他們的p16蛋白表達缺失值在26.8%～4.3%之間，很明顯，ALL復發(fā)期的p16蛋白表達缺失值低于ALL完全緩解期的p16蛋白表達缺失值，（P＜0.01）。在骨髓細胞形態(tài)學確診15例ALL患者復發(fā)之前1個月時的p16蛋白表達缺失值就都顯著低于其在完全緩解期時的該指標了。直到臨床醫(yī)師確診其復發(fā)時，此p16蛋白表達缺失值已達高峰值。

2.3 初診、ALL復發(fā)未治組患者部分臨床特征與p16蛋白表達缺失值之間的關系

①WBC＞20×109/L組的p16蛋白缺失值低于WBC＜20×109/L組的p16蛋白缺失值；②肝脾腫大組的p16蛋白缺失值也明顯低于無肝脾腫大組的p16蛋白缺失值。因P＜0.05，故其差異有統(tǒng)計學意義。提示：WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。

3 討 論

急性淋巴細胞白血病（ALL）是惡性淋巴細胞在骨髓、外周血和其他器官克隆性增殖的一種異質(zhì)性疾病，占急性白血病發(fā)病率的30%～40%[1]。

近年來，隨著血液病臨床醫(yī)學的發(fā)展，使得急性淋巴細胞白血病的基因?qū)W理論與臨床研究理論相結合的水平得到提高。

人們發(fā)現(xiàn)：p16蛋白來自p16基因，p16基因是一種新型的重要的抑癌基因，它位于細胞核染色體的9P21的位置上，是細胞核G1/S期相互轉(zhuǎn)換的關鍵性的調(diào)控基因。在正常人體組織中，p16基因可以使人體骨髓產(chǎn)生p16蛋白，這種蛋白可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的作用，該基因可以競爭細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的（即CDKS）的活性，可以直接抑制細胞增殖[2]。測定在骨髓的正常狀態(tài)——p16抑癌基因沒有失活的情況下的 p16蛋白表達值，其正常值應為陽性表達值。

而急性淋巴細胞白血病者和急性淋巴細胞白血病復發(fā)患者，其p16基因發(fā)生突變，使p16抑癌基因失活，迫使淋巴細胞內(nèi)的細胞核p16基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等調(diào)控機制失活，引起骨髓內(nèi)的淋巴系造血干細胞的核染色體的細胞分裂周期加速，使G1期縮短，特別是在DNA還沒有修復之前就使核染色體的細胞分裂過早地進入S期，導致p16第1外顯子和（或）第2外顯子甲基化[3]。這種甲基化重復發(fā)生，即過度甲基化，就勢必引起骨髓內(nèi)的淋巴造血干細胞p16基因競爭性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4和6（CDKS）的作用，使得抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）4和6的功能衰減，從而引發(fā)p16抑癌基因蛋白缺失，因此，使p16抑癌基因不能直接抑制骨髓內(nèi)的淋巴造血干細胞的增殖，導致癌性淋巴細胞過度增生——增殖失控。這就是為什么使急性淋巴細胞白血病患者骨髓不能產(chǎn)生這種p16蛋白，使在臨床上測定p16蛋白表達缺失值時，常常表現(xiàn)為低表達或表達缺失（陰性表達）的根本病因機制所在，這可能就是淋巴細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化（克隆）的關鍵。p16抑癌基因失活和p16抑癌基因蛋白表達缺失，必將導致ALL患者骨髓液p16蛋白表達為低表達或表達缺失，即導致急性淋巴細胞白血病的復發(fā)。

人體內(nèi)p16抑癌基因失活能夠引發(fā)p16蛋白表達缺失，這一機制在急性淋巴細胞白血?。ˋLL）復發(fā)機制中起著重要的作用。一些研究證明：慢性粒細胞白血病（CML）在發(fā)生急淋變的前3個月時間里就已發(fā)生p16抑癌基因失活，如果在這個期間里為其檢測p16蛋白表達值，它則顯示為表達缺失，表示該患已經(jīng)發(fā)生急淋變。即通過測定p16蛋白表達值，就可以預測慢性粒細胞白血病患者是否已發(fā)生急淋變[4]。聯(lián)合檢測不同標本的p16基因甲基化，可以提高肺癌診斷的敏感性[5]。

檢測急性淋巴細胞白血病患者的p16蛋白表達值就是檢測其體內(nèi)p16抑癌基因過度甲基化的程度，從而可以檢測到該患病程是否已進入到復發(fā)階段。

上述臨床研究表明：對照組和ALL不同病期患者p16蛋白表達（缺失）值不同；急性淋巴細胞白血?。ˋLL）不同病期患者組的p16蛋白表達值，均為陰性表達；動態(tài)檢測15例ALL患者的p16蛋白缺失值，發(fā)現(xiàn)ALL復發(fā)期的p16蛋白表達缺失值顯著低于ALL完全緩解期的該值；WBC＞20×109/L組、肝脾腫大組患者的p16蛋白缺失值均顯著降低。而確診為單純性貧血患者的p16蛋白表達值，均為陽性表達。

對ALL完全緩解后患者進行動態(tài)監(jiān)測p16蛋白表達缺失值；動態(tài)做血Rt檢查，觀察WBC計數(shù)是否其高于20×109/L、WBC分類中淋巴細胞百分比值、絕對值是否異常升高，來輔助判斷其病情的輕重。通過動態(tài)測定ALL患者p16蛋白表達值、血Rt這兩項結果，進行觀察分析，則將十分有利于醫(yī)師盡早地判斷急性淋巴細胞白血病患者是否已經(jīng)復發(fā)、是否具有復發(fā)趨勢，做出確定診斷，以便使醫(yī)師能及時地對其采取有效的治療措施，挽救其生命。同時，因為這兩項檢查易于被患者接受，故其具有廣闊的臨床應用前景。

在新推薦的診斷標準中，檢測真性紅細胞增多癥（簡稱“真紅”）高發(fā)JAK2基因突變，已被當作“真紅”診斷的一個重要指標。更有人建議真性紅細胞增多癥高發(fā)JAK2基因突變方面的檢測，可作為篩選真紅的重要方法，從而不需要進一步做骨髓活檢和血液學參數(shù)等項檢查了[6]。而急性淋巴細胞白血病是比“真紅”更厲害的惡性克隆性造血干細胞疾病，因此，對急性淋巴細胞白血病患者開展測定p16蛋白表達值是否缺失或者低下，也可作為篩選急性淋巴細胞白血病是否復發(fā)的重要方法。

在血液內(nèi)科臨床實踐中，醫(yī)師對白血病，尤其是對急性白血病患者應當持續(xù)地開展p16蛋白表達缺失值和血Rt的聯(lián)合檢測，這對醫(yī)師及時地診斷患者是否為急性淋巴細胞白血病、盡早確診某急性淋巴細胞白血病患者是否已經(jīng)復發(fā)；（慢粒白血病是否已發(fā)生急淋變），都必將起著舉足輕重的作用。

[1] 顧敏,李艷,秘營昌,等.Ph染色體陽性急性白血病38例臨床分析[J].中國實用內(nèi)科雜志,2009,29(7)：641.

[2] Tutor O,Diaz MA,Ramirez M,et al.Loss of heterozygosity of p16 correlates with minimal residual disease at the end of the induction therapy in non-high risk childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res,2007,26(9)：817-820.

[3] 陳文明,張文藝,朱嘉芷,等.急性白血病患者P16及P15基因純合子缺失及甲基化研究[J].中華血液學雜志,1999,20(9)：474-476.

[4] 許多榮,洪文德,童秀珍,等.P16基因異常與慢性粒細胞白血病關系的研究[J].中華血液學雜志,1999,20(11)：602-603.

[5] 胡灼君,劉大鷹,胡宏波,等.P16基因甲基化聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的意義[J].中國實用內(nèi)科雜志,2009,29(1)：50-52.

[6] 張連生.基因突變與真性紅細胞增多癥[J].中國實用內(nèi)科雜志,2009,29(5)：421.