肖健齊,許 晶,李新穎,康鐵江,邱麗莎,吳安華,王運杰＊

(1齊齊哈爾市第一醫(yī)院,黑龍江齊齊哈爾 161005;2中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)

腦出血是由環(huán)境因素、多種致病高危因素和遺傳因素共同作用導致的一類極其復雜的疾病,遺傳因素在腦出血的發(fā)生、發(fā)展及病理生理方面更是起著十分重要的作用。研究表明,活化 T細胞核因子1(NFATC1)基因與高血壓腦出血密切相關[1,2]。2008年 2月 ～2009年 6月,我們觀察了轉錄因子NFATC1基因rs754093多態(tài)性與高血壓腦出血的關系,從分子水平探討腦出血的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 漢族高血壓腦出血 230例(觀察組),男 144例、女 86例,年齡33～85歲,均符合全國第四次腦血管疾病學術會議修訂的高血壓腦出血診斷標準,均經臨床、CT和(或)MRI掃描確診。入選者均為臨床首次腦出血或曾有腦出血病史,但未遺留后遺癥。排除其他各種原因引起的腦出血,排除自身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病、妊娠者、甲狀腺疾病、血液病者。對照組為同期體檢的正常人群,性別、年齡、民族等與觀察組相匹配,共 233例。其中男 146例、女 87例,年齡 34～81歲。均向所有入選對象說明情況并簽署知情同意書。

1.2 NFATC1基因rs754093多態(tài)性檢測 采用多聚酶鏈反應—限制性內切酶片段長度多態(tài)性技術(PCR-RFLP)檢測。兩組均取靜脈血各5 ml,采用EDTA抗凝后,提取DNA。利用引物設計軟件Primer5.0,在含遺傳標記的DNA序列上設計PCR引物,并將設計的多對引物在BLAST網(wǎng)絡服務系統(tǒng)中進行引物的同源性比較。選出同源性最小而Tm值合適的引物確定為PCR反應引物,交由大連寶生物工程有限公司合成,反應在PCR儀上進行。正向引物為5′-AGGGGTTAAGTCCTCTCCCAAG-3′,反向引物: 5′-GGAGTCCGAGGTGACAGTGG-3′。PCR反應體系50μl,包括DNA模板50 ng,1.5mMMgCl2、0.2mM dNTPs、1.0μM引物和3 U Taq DNA聚合酶。PCR反應條件為94℃預變性 3min,94℃變性 60 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共 30個循環(huán);最后 72℃保溫7m in。AvaⅡ酶切PCR產物,20μl反應體系中,包括200 ng PCR產物、2.0μl 10倍緩沖液、10 U AvaⅡ內切酶,反應條件為 37℃溫浴過夜。產物的鑒定:8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,用凝膠顯像儀攝片。PCR產物經AvaⅡ內切酶酶切后產生T/T、T/ G、G/G基因型,因此當被檢個體為G/G基因型時,目的片段被完全切開,電泳可見到 115、98 bp條帶;當被檢個體為 T/G基因型時,一條片段被切開,而另一條片段不被切開,電泳時可見到 213、115 bp條帶;當被檢個體為 T/T基因型時,兩條片段都不能被切開,電泳僅見213 bp一條條帶。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。用Hardy-Weinberg平衡檢測基因頻率的群體代表性,四格表和R×C列表χ2檢驗分析兩組等位基因和基因型的頻率分布差異及發(fā)病風險。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

對兩組每個多態(tài)性位點基因型進行了擬合優(yōu)度χ2檢驗,結果表明其基因型頻率分布未偏離Hardy-Weinberg平衡。各rs754093基因型符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,故本研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。兩組NFATC1基因rs754093的基因型與等位基因頻率比較見表 1。相對于攜帶TT基因型,攜帶GG+TG基因型腦出血發(fā)病風險增加51.4%(P=0.030,OR=1.514,95%CI為1.040～2.204);相對于T等位基因,G等位基因腦出血發(fā)病風險增加41.1%(P=0.011,OR=1.411,95%CI為1.080～1.843)。

表1 兩組NFATC 1基因rs754093基因型和等位基因頻率比較

3 討論

近年來,隨著腦出血家族聚集現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),遺傳因素在腦出血發(fā)病中的作用備受關注,成為研究的熱點。目前,已經被證實與腦出血密切相關的因子有血管緊張素轉換酶(ACE)[3～5]、血管緊張素受體(AT1R)、凝血因子ⅩⅢ[6]、纖溶酶原激活物抑制劑-1 (PAI-1)[7]、血小板活化因子轉化酶(PAFAH)、纖維蛋白原Bβ鏈(FgBβ)及載脂蛋白(Apo)B、E和三磷酸腺苷結合盒轉運子1(ABCA1)、載脂蛋白H(Apo H)、Endoglin、胱蛋白C、Notch3、N-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、α-Adducin、α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)等。國內外最新研究發(fā)現(xiàn),轉錄因子NFATC1調控T細胞內的多種因子與血管內膜炎性反應密切相關。其調控的TNF-α等因子與高血壓密切相關,調控的COX-2等因子參與AS的形成,調控的Apo B、nur77、SREBP-1a等因子與血脂異常密切相關。血管內膜炎性反應在腦出血的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關重要的作用,高血壓是腦出血的獨立危險因素,血脂異常和動脈粥樣硬化是腦出血的病理基礎。血脂異常與高血壓、動脈粥樣硬化密切相關,三者之間互相影響,互相促進腦出血的發(fā)生和發(fā)展。由此可見,轉錄因子NFATC1與高血壓腦出血的發(fā)生發(fā)展密切相關。所以,本次研究將NFATC1作為研究腦出血病因的候選基因。

本次研究的NFATC1基因第9外顯子單核甘酸多態(tài)性(SNP)rs754093mRNA第2 704位堿基T-G突變,使密碼子序列改變(TGT-GGT),從而導致半胱氨酸(Cys)轉變成甘氨酸(Gly),這個SNP位點存在錯義突變,是功能性SNP。本研究發(fā)現(xiàn),中國漢族人群NFATC1第9外顯子上的多態(tài)性位點rs754093為T/G二態(tài),存在T/T、T/G、G/G三種基因型。查詢http://www.ncbi.nlm.nih.gov中的Population Diversity,發(fā)現(xiàn)中國對照組漢族人G/G基因型及等位基因頻率與日本人、歐洲人、非洲人比較存在顯著性差異,中國漢族人G等位基因頻率(0.335)顯著低于歐洲人(0.526)及日本人(0.466),而高于非洲人(0.169)。由此可見,NFATC1基因rs754093多態(tài)性分布存在種族差異,可能是由于突變、選擇、隨機遺傳漂移、建立者效應或遷移等因素對其的影響造成的,從而導致不同種族或隔離群體等位基因、基因型頻率間存在程度不同的差別。我們研究發(fā)現(xiàn), NFATC1基因rs754093多態(tài)性與高血壓腦出血顯著相關,觀察組SNP rs754093 G/G基因型明顯高于對照組,G/G+T/G基因型攜帶者較T/T基因型人群發(fā)生腦出血的相對風險度為1.514,G等位基因攜帶者較 T等位攜帶者人群發(fā)生腦出血的相對風險度為1.411。研究表明,rs754093的G/G基因型是高血壓腦出血發(fā)生的一個獨立危險因素,其風險性主要來源于G等位基因。

我們初步研究了中國漢族人群轉錄因子NFATC1基因第9外顯子上的SNP rs754093基因型分布,本次研究為進一步探索轉錄因子NFATC1與高血壓腦出血關系的相應功能學研究奠定了基礎,而且如果我們發(fā)現(xiàn)更多與腦出血密切相關的轉錄因子的SNP,將大大縮小探索腦出血致病基因的范圍這不僅有助于腦出血高危人群的早期檢測,而且可為腦出血預防、治療和藥物設計奠定全新的基礎。

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