洪 練 李 競(jìng) 高 凌 陳紅敏

高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞對(duì)TGF-β1、FN、Smad7表達(dá)的影響

洪 練 李 競(jìng) 高 凌 陳紅敏

本文2010—12—14收到，2011—03—02修回，2010—03—04接受

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因［1］，雖然糖尿病患者的高血糖、高血脂、高血壓有很多好的治療控制方法，但DN的發(fā)病率仍然居高不下。因此，研究DN的發(fā)生機(jī)制和治療方案是臨床亟待解決的問(wèn)題。Smad蛋白是目前唯一所知的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1（TGF-β1）的 胞 內(nèi) 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 因 子［2］，Smad7 是TGF-β1／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，在DN的發(fā)病過(guò)程中，Smad7的表達(dá)失衡可能是致病環(huán)節(jié)之一。本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察高糖狀態(tài)下TGF-β1、纖維連接蛋白（FN）增多的同時(shí)，Smad7表達(dá)的變化，探討Smad7在細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）沉積中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

FN、TGF-β1 ELISA試劑盒購(gòu)自中國(guó)博士德公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒由立陶宛Fer-mentas公司提供；Smad7多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體由美國(guó)Santa Cruz公司出品；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗羊抗兔二抗，NC膜、RIPA裂解液、PMSF、凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、封閉液、一抗二抗稀釋液、ECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒均為碧云天公司產(chǎn)品；TGF-β1、FN、GAPDH 引物由上海生工合成；T Personal型PCR儀由德國(guó)Biometra公司生產(chǎn)；Gel Doc2000凝膠成像掃描分析系統(tǒng)由美國(guó)Biorad公司出品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

人腎小球系膜細(xì)胞（HMCs）購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，以含15%的胎牛血清及含青霉素和鏈霉素（100μg／L）的DMEM 低糖（5.6mmol／L）培養(yǎng)基，置37℃孵箱（5%CO2）培養(yǎng)，2～3天換液1次。按0.3×106／孔密度將上述細(xì)胞均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，80%融合后換無(wú)血清DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h以同步化細(xì)胞，作為低糖培養(yǎng)對(duì)照組；隨后換30mmol／L高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h，分別為高糖培養(yǎng)24h組、48h組和72h組，后分別收集上清液并提取蛋白、RNA；—70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR檢測(cè) TGF—β1、FN、Smad7mRNA表達(dá)

Trizol試劑盒一步法提取各組細(xì)胞總RNA，取2μg，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，應(yīng)用特異性 TGF-β1、FN、Smad7及 GAPDH 引物行PCR擴(kuò)增。TGF-β1引物：上游引物5’-GGT GGA AAC CCA CAA CGA A-3’，下游引物5’-CTA AGG CGA AAG CCC TCA AT-3’，終產(chǎn)物為321bp。Smad7引物：上游引物5’-AGC AGG CCA CAC ACT TCA AACT -3’，下游引物 5’-CAC GTT GTC TCC CCA TCT G-3’，終產(chǎn)物為375bp。FN引物：上游引物5’-TAG CCC TGT CCA GGA GTT CA-3’，下游引物5’-CTG CAA GCC TTC AAT AGT CA -3’，終產(chǎn)物為346bp。GAPDH引物：上游引物5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，終產(chǎn)物為452bp。TGF-β1反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃30s、58℃30s、72℃50s循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min；Smad7反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃40 s、56℃30s、72℃50s循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min；FN反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃30s、60℃30s、72℃50s循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠電泳圖像掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因片段與GAPDH片段的條帶灰度比值表示相對(duì)含量。

1.4 ELISA檢測(cè) TGF—β1、FN蛋白表達(dá)

收集培養(yǎng)不同時(shí)間的HMCs上清液，依照試劑盒說(shuō)明的方法測(cè)定其TGF—β1、FN濃度。每份標(biāo)本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以其均值代表實(shí)驗(yàn)數(shù)值。

1.5 Western blotting檢測(cè)Smad7蛋白表達(dá)

用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取總蛋白75μg經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果并標(biāo)示相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。然后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h。洗膜后加入Smad7抗體（1∶800稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜。再用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔多抗（1∶5000稀釋?zhuān)╇s交1h；洗膜后加ECL（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光），最后將硝酸纖維膜放入X線片暗盒，壓片、顯影、定影。用分析系統(tǒng)軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，測(cè)定雜交條帶的吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 高糖培養(yǎng) HMCs不同時(shí)間對(duì) TGF-β1、FN、Smad7 m RNA表達(dá)的影響

本試驗(yàn)中所提取RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S、18S、5S清晰可見(jiàn)，A260／A280在1.8～2.0，提示所提RNA結(jié)構(gòu)完整，純度較高。各組TGF-β1、FN mRNA表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1、圖1和圖2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，高糖培養(yǎng)各組TGF—β1、FN mRNA表達(dá)均較低糖對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；TGF-β1 mRNA表達(dá)在培養(yǎng)48h達(dá)到高峰；FN mRNA表達(dá)隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。Smad7 mR-NA表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1和圖3。隨著高糖培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Smad7 mRNA表達(dá)較低糖對(duì)照組下降，從48h開(kāi)始兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表達(dá)結(jié)果（灰度比值，±s，n均＝3）

表1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表達(dá)結(jié)果（灰度比值，±s，n均＝3）

注：與低糖對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組 別 TGF-β1 0.37±0.01 0.40±0.06 0.78±0.12培養(yǎng)24h組 0.64±0.022） 0.78±0.172） 0.64±0.10培養(yǎng)48h組 0.67±0.012） 0.82±0.142） 0.60±0.141）培養(yǎng)72h組 0.64±0.012） 0.91±0.172） 0.59±0.131）FN Smad7低糖對(duì)照組

圖1 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間對(duì)TGF—β1 mRNA表達(dá)的影響

圖2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間對(duì)FN mRNA表達(dá)的影響

圖3 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間對(duì)Smad7 mRNA表達(dá)的影響

2.2 高糖培養(yǎng) HMCs不同時(shí)間對(duì)TGF—β1、FN蛋白濃度的影響

與低糖對(duì)照組相比，高糖各組TGF-β1、FN蛋白濃度均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；TGF-β1在48h到達(dá)高峰，F(xiàn)N濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而升高。見(jiàn)表2。

表2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間后TGF—β1和FN蛋白濃度變化（±s，n均＝3）

表2 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間后TGF—β1和FN蛋白濃度變化（±s，n均＝3）

注：與低糖對(duì)照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組 別 TGF-β1（pg／ml） FN（ng／ml）低糖對(duì)照組274.48±10.28 44.13±2.29培養(yǎng)24h組 316.07±27.202） 95.57±10.912）培養(yǎng)48h組 324.40±16.892） 166.74±16.342）培養(yǎng)72h組 314.23±19.771） 236.94±13.202）

2.3 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間對(duì)Smad7蛋白表達(dá)的影響

與低糖對(duì)照組比較，高糖培養(yǎng)各組Smad7蛋白表達(dá)均下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）見(jiàn)圖4。

圖4 高糖培養(yǎng)HMCs不同時(shí)間對(duì)Smad7蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

DN是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，也是尿毒癥的主要病因之一。腎小球ECM累積所致的腎小球硬化對(duì)DN患者腎功能衰竭的進(jìn)展有著非常重要的意義。FN是ECM的主要組成成分，在正常腎組織中主要分布于腎小球系膜區(qū)，對(duì)維持腎小球正常結(jié)構(gòu)起重要作用。Van Det等［3］研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度升高可刺激HMCs的FN m RNA表達(dá)及FN蛋白合成，這種作用通過(guò)TGF介導(dǎo)，在很大程度上依賴(lài)于內(nèi)源性 TGF—β1活性的增高，而抗 TGF—β1中和抗體可在蛋白質(zhì)或mRNA水平逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)［4］。研究發(fā)現(xiàn)TGF—β1是致腎纖維化的核心因子，參與腎小球硬化的各個(gè)環(huán)節(jié)。活化的TGF-β1可能增加基質(zhì)蛋白的合成（如膠原蛋白、FN、糖蛋白）和分泌，加強(qiáng)細(xì)胞黏附蛋白受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和處理，減少基質(zhì)降解蛋白酶的合成，增加這些蛋白酶特異抑制物的合成，從而對(duì)組織細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化過(guò)程起到重要作用［5，6］。郭鵬等［7］在糖尿病大鼠模型的 腎小球及腎小管中發(fā)現(xiàn)TGF—β1表達(dá)較正常組增加；Yamamoto等［8］測(cè)定53例不同腎病組織中 TGF—β1 mRNA水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，微小病變腎組織的TGF-β1 m RNA表達(dá)與正常組織沒(méi)有明顯差異，而以ECM積聚為特征的DN、局灶節(jié)段增生性腎小球硬化、新月體性腎小球腎炎等的腎小球TGF—β1 m RNA水平顯著增高。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高糖培養(yǎng)HMCs，發(fā)現(xiàn)TGF—β1和FN的mRNA和蛋白表達(dá)較低糖對(duì)照組顯著增加，這與以上的研究相一致。但Smad7的表達(dá)量卻較低糖對(duì)照組減少。Smad蛋白是目前唯一所知的TGF-β胞 內(nèi) 信 號(hào) 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 因 子，Smad7 在 TGF—β1／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起主要的負(fù)反饋?zhàn)饔?，是?xì)胞中TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）絲氨酸／蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，能牢固地與TβRⅠ結(jié)合，使之無(wú)法將Smad 2／3磷酸化而阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程；另一方面，Smad7可阻止TGF-β依賴(lài)的Smad 2／4復(fù)合體的形成，從而抑制Smad2向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，以減少Smad2介導(dǎo)啟動(dòng)的FN基因的表達(dá)；此外，Smad7還可募集Smad-泛素化調(diào)節(jié)因子（Smurf l和 Smurf 2）至TGF-β受體，促進(jìn)TGF-β受體發(fā)生蛋白酶降解，從而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［9］。Hong等［10］在研究db／db小鼠的TGF-β1／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TGF-β1及TβRⅡ除在腎小球、腎小管表達(dá)增多外，smad2／3蛋白在其細(xì)胞漿及細(xì)胞核表達(dá)也增多，但Smad7表達(dá)卻減少。本實(shí)驗(yàn)中HMCs在高糖刺激下，TGF-β1和FN表達(dá)增加，而Smad7表達(dá)減少，在同樣以纖維化病變?yōu)樘卣鞯钠つw、肝臟、肺臟疾病中也發(fā)現(xiàn)Smad7表達(dá)的減少，結(jié)合前述的研究成果，筆者認(rèn)為Smad7表達(dá)的減少在一定程度上導(dǎo)致了FN表達(dá)的增加，參與了DN的發(fā)生。對(duì)Smad7在DN中的表達(dá)變化進(jìn)行深入研究，將進(jìn)一步有助于闡明DN的發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上探尋新的防治DN的措施。

本文第一作者簡(jiǎn)介：

洪 練（1985～），女，漢族，碩士研究生，研究方向：糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制

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高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞對(duì)TGF—β1、FN、Smad7表達(dá)的影響

洪 練，李 競(jìng)，高 凌，等／武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢430060

目的：通過(guò)觀察高糖對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞（H MCs）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、Smad7表達(dá)的影響，探討糖尿病腎?。―N）的發(fā)病機(jī)制。方法：將HMCs于高糖（30mmol／L）環(huán)境培養(yǎng)不同時(shí)間后，采用 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β1、FN、Smad7 mRNA 表達(dá)，Western blotting檢測(cè)Smad7蛋白的表達(dá)，采用ELISA檢測(cè)TGF—β1、FN蛋白水平，同時(shí)以低糖培養(yǎng)作為對(duì)照組。結(jié)果：高糖培養(yǎng)24h、48h、72h后，TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)均較低糖培養(yǎng)對(duì)照組增加，在48h時(shí)達(dá)到高峰；FN m RNA及蛋白的表達(dá)亦較對(duì)照組增加，且呈時(shí)間依賴(lài)性；而Smad7 mRNA及蛋白表達(dá)下降。結(jié)論：TGF-β1／Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑負(fù)反饋調(diào)節(jié)Smad7蛋白的表達(dá)減少，可能是DN發(fā)病過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一。

Effect of High Glucose on Transforming Growth Factor-β1，F(xiàn)ibronectin and Smad7 Expression in Human Glomer-ulus Mesangial Cells

Hong Lian，Li Jing，Gao Ling，et al／Department of Endocrinology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

Diabetic nephropathy； TGF-β1； Fibronectin；Smad7；Human glomerulus mesangial cell

R587.2 R692.6

A

1005—1740（2011）02—0013—04

武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，郵政編碼 武漢430060； 通訊作者：李 競(jìng)，E-mail：lijing7823＠hotmail.com

book=2011,ebook=19

Objective：To explore the effect of high glucose on transforming growth factor-β1（TGF-β1），fibronectin（FN）and Smad7 expression in hu-man glomerulus mesangial cells（H MCs）.Method：HMCs were grown in DMEM medium containing 30mmol／L high glucose for some time（24h，48h，72h）.The expression of TGF-β1，F(xiàn)N，Smad7 mRNA were detected by RT-PCR and western blotting were used to detect the expression of Smad7 while the supernatant level of TGF-β1 and FN were detected by ELISA.Results：In HMCs induced by high glucose，the mRNA and pro-tein expression of TGF-β1 were improved and come to the most after 48h，the mRNA and protein expression of FN were up-regulated in a time-dependent manner，however Smad7 was down-regulated.Conclu-sion：High glucose can stimulate the expression of extracellular matrix excessively，to some degree，it may owe to the reduction of Smad7 which is a major I-Smad in TGF-β1／Smad signaling pathway.

糖尿病腎病 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β1 纖維連接蛋白 Smad7 人腎小球球系膜細(xì)胞／高糖培養(yǎng)