劉 蓓 王 瓊 范 軍 賀玉娟 付 軍 孫幼芳 曾桃英

FAT10基因表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系

劉 蓓 王 瓊 范 軍 賀玉娟 付 軍 孫幼芳 曾桃英

本文2010—11—05收到，2011—01—16修回，2011—03—11接受

結(jié)直腸癌（CCT）是最常見的惡性腫瘤之一。在消化道腫瘤中，其發(fā)病僅次于胃癌和食管癌而居第三位，在全球的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢［1］。有研究報(bào)道，我國CCT也是由低發(fā)趨向于高發(fā)，統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國2005年CCT發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)分別達(dá)17.2萬和9.9萬，已超過美國［2］。FAT10（Diubiquitin，雙泛素）基因是近年來發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因，由165個氨基酸殘基組成，屬于泛素蛋白家族中的泛素樣修飾蛋白（UBLs），分子量18 KD，由兩個泛素樣部分前后融合而成，它的N端有29%、C端有36%與泛素相同［3，4］。FAT10參與各種基本的細(xì)胞行為，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白易位、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控［5，6］。近來研究發(fā)現(xiàn)FAT10的表達(dá)上調(diào)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Lee等［7］研究發(fā)現(xiàn)FAT10在肝癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，提示FAT10在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。本研究通過檢測CCT樣本FAT10基因m RNA的表達(dá)，分析FAT10表達(dá)與CCT患者臨床病理資料之間的關(guān)系，旨在為CCT的預(yù)防、早期診斷提供理論依據(jù)，并為基因治療提供新的靶分子。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2000年5月31日～2003年5月31日CCT組織標(biāo)本73例，患者年齡23歲～85歲，平均年齡55±6.8歲。按照2003年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國腫瘤聯(lián)合會（AJCC）聯(lián)合制定的TNM分期法和改良DUKES分期法對CCT患者進(jìn)行臨床分級，其中臨床分級I期和II期患者共39例，III期和IV期患者共48例，詳細(xì)臨床資料見表1。同時收集相同患者癌旁組織（TCT）和正常結(jié)直腸組織（NCT），所收集標(biāo)本均在手術(shù)切除后30min內(nèi)采集，隨后迅速保存于液氮中備用。以上所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)確證。

1.2 組織總RNA提取

分別取適量保存于液氮中的CCT、TCT和NCT，在液氮中研磨成粉末狀后，按照TrizolTM試劑盒（MBI公司）操作說明采用氯仿異丙醇法提取組織總RNA。所提取總RNA用適量無RNase去離子水充分溶解后，保存于—70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR

取適量提取的CCT、TCT和NCT總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI公司）操作說明逆轉(zhuǎn)錄為cD-NA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增FAT10基因，擴(kuò)增引物為：Forward-Primer 5'-AAA CAC AGC AAT CCA GGC A-3'，Reverse-Primer 5'-CCC GTC TTA GTC TCG ATC ATT-3'。以GAPDH為內(nèi)參照，其擴(kuò)增引物為：Forward-Primer 5'-ATG CTG GCG CTG AGT ACG T-3'，Reverse-Primer 5'-TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'。以上引物均由上海生物工程有限公司合成，擴(kuò)增片段大小分別為474bp和652bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃3min，94℃30s，56℃45s，68℃30s，共27個循環(huán)，最后68℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取適量PCR產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝像，然后進(jìn)行灰度掃描，分析擴(kuò)增片段灰度值，以FAT10表達(dá)灰度值與GAPDH表達(dá)灰度值比值為縱坐標(biāo)，比較FAT10在CCT、TCT和NCT中的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以陽性率（%）計(jì)數(shù)FAT10 m RNA在CCT中的表達(dá)情況，采用Chi-square檢驗(yàn)或Fisher確切概率法分析不同臨床資料之間的差異。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示FAT10 mRNA在CCT中的相對表達(dá)量，采用t檢驗(yàn)分析FAT10 mRNA相對表達(dá)量在不同臨床資料之間的差異。生存率采用Kaplan—Meier法計(jì)算，生存期差別的比較采用Log-Rank（Mantel-Cox）時序檢驗(yàn)。以上所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 FAT10在CCT組織中的表達(dá)

提取CCT總RNA后，紫外分光光度計(jì)測定其A260／A280，其比值在1.8～2.0之間，說明提取的總RNA質(zhì)量良好。RT-PCR后2.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，F(xiàn)TA10 m RNA在73例CCT、TCT和NCT中有不同程度的表達(dá)（圖1A）。進(jìn)一步分析FAT10相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在CCT中的相對表達(dá)量（0.664±0.042）明顯高于 TCT（0.525±0.037）（P＜0.05），而TCT中的FAT10相對表達(dá)量明顯高于 NCT（0.377±0.029）（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 FAT10 mRNA在CCT組織中的表達(dá)

2.2 各種臨床病理因素對FAT10陽性表達(dá)的影響

本研究收集的73例CCT標(biāo)本中，6例因臨床資料不完善而不進(jìn)行此次分析。67例CCT患者詳細(xì)臨床資料與FAT10陽性表達(dá)情況見表1。分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10在CCT的陽性表達(dá)率為52.24%（35／67），其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CCT的陽性率明顯高于未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05）。TNM分級III＋I(xiàn)V級CCT的陽性表達(dá)率明顯高于I＋I(xiàn)I級者 （P＜0.05）。CCT患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤臨床進(jìn)展、分化程度等對FAT10的陽性表達(dá)率無明顯影響（P＞0.05）。

表1 各種臨床病理因素對FAT10 mRNA陽性表達(dá)率（n，%）的影響

2.3 各種病理因素對FAT10相對表達(dá)量的影響

FAT10在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CCT中的相對表達(dá)量明顯高于沒有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01）。TNM分級為III＋I(xiàn)V級CCT患者的FAT10相對表達(dá)量明顯高于I＋I(xiàn)I級（P＜0.01）。而CCT患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤臨床進(jìn)展、分化程度等對FAT10的相對表達(dá)量無明顯影響（P＞0.05）。

表2 多種臨床病理因素對FAT10 mRNA相對表達(dá)量的影響（±s）

表2 多種臨床病理因素對FAT10 mRNA相對表達(dá)量的影響（±s）

臨床病理因素 FAT10 mRNA陽性例數(shù) 相對表達(dá)量t P 值年齡（歲）＜50 8 0.59±0.04 1.79 ＞0.05≥50 27 0.62±0.03腫瘤大?。╟m）＜5 15 0.60±0.04 0.45 ＞0.05≥5 20 0.60±0.02腫瘤進(jìn)展早期 8 0.63±0.03 1.48 ＞0.05中晚期 27 0.62±0.04分化程度高分化或中分化 6 0.57±0.03 1.04 ＞0.05低分化或未分化 29 0.58±0.02淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有27 0.70±0.03 14.38 ＜0.01無8 0.52±0.02遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有11 0.63±0.02 1.30 ＜0.05無24 0.61±0.03 TNM分級I＋I(xiàn)I 8 0.54±0.04 8.48 ＜0.01 III＋I(xiàn)V 27 0.67±0.03

2.4 FAT10表達(dá)與術(shù)后生存率的關(guān)系（Kaplan-Meier生存分析）

截止到2010年4月，67例CCT患者均有5年以上完整隨訪資料。31例CCT患者在術(shù)后5年隨訪期間死于CCT復(fù)發(fā)。FAT10表達(dá)陰性患者平均生存期為49.4月，而FAT10表達(dá)陽性患者的平均生存期為29.7月，后者明顯低于前者，兩組生存率差異顯著（Chi-square＝7.21，P＜0.05）。見圖2。

圖2 FAT10 mRNA表達(dá)與CCT患者生存時間的關(guān)系

3 討 論

FAT10屬于泛素蛋白家族中UBLs家族的成員之一，許多上皮源性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，在細(xì)胞分裂前、中期通過干擾著絲粒的定位導(dǎo)致細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性增加［8］。FAT10主要在胞核中表達(dá)，提示其有可能通過參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［9］。

Caroline等［10］研究發(fā)現(xiàn)90%肝癌患者FAT 10蛋白表達(dá)水平上調(diào)，同時，F(xiàn)AT 10蛋白表達(dá)水平在胃癌、CCT等胃腸道腫瘤及婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中也上調(diào)。Lim等［11］研究發(fā)現(xiàn)FAT10 mRNA在結(jié)腸癌、肝癌等細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，在胃癌、結(jié)腸癌等胃腸道腫瘤及婦科生殖系統(tǒng)腫瘤中也上調(diào)，這種表達(dá)上調(diào)主要出現(xiàn)在處于細(xì)胞周期的S細(xì)胞，提示FAT 10可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2／M期促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR方法檢測CCT中FAT10 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CCT組織FAT10 mRNA的陽性表達(dá)率為52.24%，明顯高于NCT和TCT，與有關(guān)報(bào)道［2］相一致，提示FAT10在CCT的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10的陽性率與CCT淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CCT TNM分級有關(guān)，而與腫瘤大小、大體類型和分化程度無顯著關(guān)系，提示FAT10參與了CCT的局部轉(zhuǎn)移，說明FAT10可能與CCT的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

分析FAT10的表達(dá)與CCT患者生存期之間的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT10表達(dá)陰性患者平均生存期為49.4月，而FAT10表達(dá)陽性患者的平均生存期為29.7月，提示FAT10的高表達(dá)可能與患者生存相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行 Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)AT10表達(dá)陽性組生存率明顯低于FAT10表達(dá)陰性組（P＜0.05），提示FAT10的表達(dá)有可能是CCT患者預(yù)后監(jiān)測的指標(biāo)之一。

通過對FAT10基因的深入研究，探討其在CCT發(fā)生、發(fā)展中的作用，提示FAT10有可能成為CCT一個新的腫瘤標(biāo)志物而用于CCT的預(yù)后監(jiān)測。關(guān)于FAT10在CCT中的發(fā)生機(jī)理、診斷及預(yù)后價(jià)值、治療作用等尚需進(jìn)一步研究。

本文第一作者簡介：

劉 蓓（1976～），女，漢族，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤免疫學(xué)方面的研究

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FAT10基因表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系

劉 蓓，王 瓊，范 軍，等／武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院病理科，武漢430064

目的：探討結(jié)直腸癌（CCT）組織中FAT10（Diubiquitin，雙泛素）的基因表達(dá)與其病理因素及預(yù)后的關(guān)系。方法：收集我院2000～2003年73例有5年以上完整隨訪資料的結(jié)直腸癌術(shù)后患者，采用RT-PCR方法檢測FAT10 mRNA在CCT、癌旁組織（TCT）和正常結(jié)直腸組織（NCT）中的表達(dá)情況，并分析臨床病理因素對FAT10陽性表達(dá)率和相對表達(dá)量的影響，以及FAT10表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：FAT10 mRNA在CCT陽性表達(dá)率為52.24%（35／67），且在CCT的相對表達(dá)量（0.735±0.034）明顯高于 TCT（0.561±0.044）和 NCT（0.397±0.028）（P＜0.05）；FAT10 mRNA的陽性表達(dá)率及相對表達(dá)量受臨床進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分級的影響較明顯（P＜0.05），而患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度等對其無明顯影響（P＞0.05）；Log-Rank檢驗(yàn)顯示CCT患者中，F(xiàn)AT10表達(dá)陽性者生存率明顯低于FAT10表達(dá)陰性者（P＜0.01）。結(jié)論：FAT10在CCT的表達(dá)狀況與CCT轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切，可以作為反映生物學(xué)行為和判斷預(yù)后的有效指標(biāo)。

Analysis the Relatvie of FAT10 Expression with Clinico-pathological Features and Prognosis of Colorectal Canc-er

Liu Bei，Wang Qiong，F(xiàn)an Jun，et al／Department of Pathology，Affiliated Tianyou Hospital of Wuhan Uni-versity of Science and Technology，Wuhan，430064

FAT10 gene；Colorectal cancer；Prognosis

R364.3

A

1005—1740（2011）02—0019—04

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院病理科，郵政編碼 武漢430064；通訊作者：曾桃英，E-mail：liubei1976＠126.com，Tel：027-51164947

Objective：To investigate the relationship between expression of FAT10 in colorectal cancer and its clinicopathologic significance.Method：Collected 73 cases in 2000～2003 in our hospital over 5 years follow-up data complete the colorectal cancer patients using RT-PCR to detect FAT10 mRNA expression in colorectal cancer tissues and tumor adjacent tissue，the normal colon tissue as control，and relation of FAT10 expres-sion with clinicopathological features and clinical outcomes of colorectal cancer patients were analyzed.Results：The intensive positive rate of FAT10 mRAN expression in colorectal cancer was 52.24%（35／67）.Ex-pression of FAT10 was significantly correlated with lymph node metasta-sis and clinical stage and TNM staging（P＜0.05），but not with age，tumor size and tumor differentiation，etc.（P＞0.05）.In the intensive positive rate of FAT10 expression in colorectal cancer，the survival rate was significantly lower than negative ones（P＜0.01）.Conclusion：Over-expression of FAT10 in patients with colorectal cancer enhances the pos-sibility of invasion and metastasis，implying a poor prognosis.FAT10 may serve as fairly a good prognostic factor to indicate biologic behavior and prognosis in colorectal cancer.

FAT10基因 結(jié)直腸癌 預(yù)后

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