成映霞，段永強，朱立鳴，李萬義

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是消化系統(tǒng)疾病治療中的難點之一，屬于癌前病變。老年CAG特別是CAG伴腸上皮化生和異常增生者，其胃癌發(fā)生率高達10%［1］，而內(nèi)皮素異常增高、自由基損傷在胃黏膜炎癥、萎縮病變中具有重要的誘導作用［2、3］。治萎防變膠囊是基于臨床效方而研制的療效確切的醫(yī)院制劑，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎。本研究旨在通過實驗觀察治萎防變膠囊對CAG大鼠血漿ET-1含量和胃組織氧自由基域的影響，探討其防治CAG的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物造模與分組

采用Wistar大鼠 90只，體重 180g±20g，雌雄各半，標準飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心提供，SPF級動物合格證號 SCXK［甘］2004-0006-0000202。

除空白對照組10只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余大鼠氣虛血瘀型CAG造模參照陸為民方法［4］:(1)用滅菌水將甲基硝基亞硝基胍(N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)配成 0.1mg∕ ml濃度給大鼠自由飲用(避光)，每日配制1次;(2)采用饑飽失常喂養(yǎng)法:2d足量喂養(yǎng)，1d禁食;(3)鹽酸雷尼替丁膠囊按每天0.03g/kg灌胃，每日1次。綜合造模60d后，每隔1周殺檢大鼠，取胃黏膜做病理檢查判定腸化生的情況，至第12周大鼠胃黏膜腸化生形成后開始治療。將CAG大鼠按體重編號，用隨機數(shù)字表法分為模型組、治萎防變(Zhiweifangbian，ZWFB)大劑量組、ZWFB中劑量組、ZWFB小劑量組和維酶素組，每組9只，雌雄各半分籠飼養(yǎng)。

灌胃給藥治療共90d。空白對照組、模型組給予同體積蒸餾水灌胃;ZWFB大、中、小劑量組分別給予 0.6g·kg－1·d－1、0.3g·kg－1·d－1和 0.15g·kg－1·d－1ZWFB藥劑灌胃(相當于 60kg成人劑量的10倍、5倍和 2倍);給予對照組 0.25g·kg－1·d－1維酶素灌胃(相當于60kg成人劑量的5倍)，等效劑量按人與動物體型系數(shù)折算［5］。塊的冷水中)，后以 3500r/min離心10min，取上清液置4℃冰箱保存待測。

1.4 統(tǒng)計學處理

1.2 試劑與儀器

治萎防變膠囊，批號061208(甘肅中醫(yī)學院附院制劑室制備，0.4g/粒);維酶素，批號060407(山東魯北藥業(yè)有限公司，0.2g/片);考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，批號20071119;脂質(zhì)過氧化物(Lipid peroxidation，LPO)試劑盒，批號 20071120;丙二醛(Malondialdehyhe，MDA)試劑盒，批號 20071118;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒，批號20071120;谷胱甘肽-過氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)試劑盒，批號 20071120(南京建成醫(yī)學生物研究所);內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)放免試劑盒，批號20071119(北京北方生物技術(shù)研究所);甲基硝基亞硝基胍(MNNG)，批號 68051，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品;鹽酸雷尼替丁膠囊，批號0611025(江西匯仁藥業(yè)有限公司);DF110型電子分析天平;721型可見光分光光度計;XYJ80-2離心機;HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱;FT-630G微機多探頭r計數(shù)器;KDC-2044低速冷凍離心機。

所有數(shù)據(jù)均輸入計算機，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(珋x±s)表示，組間樣本均數(shù)差異的比較選用F檢驗，在F檢驗有統(tǒng)計學意義時，進一步用q檢驗進行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿ET-1含量的比較

表1顯示，與空白組比較，模型組大鼠血漿ET-1計數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組血漿ET-1計數(shù)水平降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠血漿ET-1含量比較(珋x±s)

1.3 標本采集

CAG造模成功并治療后，各組動物于末次灌胃給藥后，禁食不禁水24 h，測體重做記錄后用烏拉坦1.5g/kg腹腔注射麻醉并取材。

股動脈取血2ml注入含10%EDTA二鈉3μl和抑肽酶 40μl的試管中，混勻，3000r/min離心10min，取血漿，置于－20℃冰箱保存待檢ET-1。

胃組織勻漿制備:采血后斷頭處死，低溫條件下快速剖取胃組織，以冰冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿(勻漿器的末端置于放冰

2.2 各組大鼠胃組織SOD活性和MDA含量比較

表2顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃組織SOD計數(shù)水平降低，MDA計數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組SOD計數(shù)水平升高，MDA計數(shù)水平升降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。

表2 各組大鼠胃組織SOD活性和MDA含量比較(珋x±s)

2.3 各組大鼠胃組織GSH-Px活性和LPO含量比較

表3顯示，與空白組比較，模型組大鼠胃組織GSH-Px計數(shù)水平降低，LPO計數(shù)水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01);經(jīng)治萎防變膠囊治療后并與模型組比較，治萎防變膠囊各劑量組GSH-Px計數(shù)水平升高，LPO計數(shù)水平升降低，且以治萎防變膠囊大劑量效果顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。

表3 各組大鼠胃組織GSH-Px活性和LPO含量比較(珋x±s)

3 討論

慢性萎縮性胃炎屬中醫(yī)“痞滿”、“胃脘痛”范疇，其病機特點為氣血兩虛、瘀血內(nèi)停的虛實夾雜之癥，其中血瘀是CAG的主要病理基礎。因本病病程遷延，反復難愈，病變由氣入血、由經(jīng)入絡，又易導致因虛致瘀的病理改變，這與現(xiàn)代醫(yī)學“胃黏膜血循環(huán)障礙”的認識相一致［6］。

內(nèi)皮素(ET)是一種強力血管收縮因子。近年發(fā)現(xiàn)，胃腸黏膜上皮可產(chǎn)生ET，并認為是胃黏膜損傷作用最強的內(nèi)源性遞質(zhì)，多種原因誘發(fā)的胃黏膜損傷均能使 ET 水平升高［7］。據(jù)報道［8］，CAG 患者胃黏膜血流量(Gastric mucosal blood flow，GMBF)較非萎縮性胃炎明顯降低，推測GMBF降低是CAG發(fā)病的重要因素之一，由于胃黏膜血液供應減少，胃黏膜容易受損，促進腺體萎縮。研究結(jié)果表明［9］，ET參與了CAG的病變進程，其含量的變化與萎縮的程度有關(guān)。由此可見，胃黏膜血流量的降低是導致萎縮性胃炎的主要原因之一。ET-1為ET的異體之一，具有強烈的血管收縮作用，對胃黏膜的損傷作用已為許多研究確認。在動物模型中，藥物等［10、11］誘發(fā)胃黏膜損害時，血漿或胃黏膜內(nèi)ET-1濃度均有升高，而ET-1含量的升高會導致胃黏膜血流量降低，提示ET-1在動物胃黏膜損害的發(fā)病機制中起重要作用。

近年來，關(guān)于氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)在胃黏膜致炎、致癌致突變方面的研究日益重視，由于ROS作用于生物膜上不飽和脂肪酸可產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物(LPO)，進一步導致胃黏膜炎癥、萎縮甚至異形增生發(fā)生。研究表明，大鼠受MNNG攻擊的早期反應主要是過氧化反應增強［12］，蓄積在體內(nèi)的自由基(Free radicals，F(xiàn)R)可以攻擊脂類、蛋白質(zhì)、核酸，而由磷脂和蛋白質(zhì)結(jié)合生成的脂蛋白為主要成分的生物膜極易受到FR的攻擊，生物膜的磷脂由于自由基反應，而生成脂質(zhì)過氧化物LPO并在脂質(zhì)過氧化的同時還可引起新的FR生成。LPO可分解成MDA，而 MDA、LPO易與膜蛋白、膜脂上的–NH2交聯(lián)形成mchiff's堿，使生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，降低了膜的流動性，使膜功能降低甚至喪失，影響到整個細胞代謝功能、結(jié)構(gòu)的改變，從而引起細胞的老化、死亡。SOD、GSH-Px是體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)中最重要的酶類，在胃壁細胞內(nèi)活性很高，其作用的重要意義在于清除H2O2和OH的前身，從而保護細胞不受毒性FR的損傷。

治萎防變膠囊主要由人參、枳實、白術(shù)、半夏、白花蛇舌草、三七等藥物經(jīng)過提取、分離而組成，主治氣虛血瘀型慢性萎縮性胃炎?，F(xiàn)代藥理研究證明，人參［13］、枳 實［14］、白 術(shù)［15］、半 夏［16］、白 花 蛇 舌草［17］、三七［18］所含有效成分具有不同程度改善胃腸平滑肌運動、解痙鎮(zhèn)痛、抗自由基損傷、抑制血小板聚集、抑殺幽門螺桿菌以及誘導腫瘤細胞凋亡、抗腫瘤的作用。

本研究觀察到，與空白組比較，模型組大鼠血漿ET-1含量顯著升高;胃組織 GSH-Px、SOD活性顯著降低，MDA、LPO含量顯著升高，說明CAG狀態(tài)下所造成的胃損傷已影響到機體黏膜組織的血循環(huán)和氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡。而CAG造模成功并經(jīng)藥物治療后，治萎防變膠囊能顯著降低血漿ET-1含量，顯著提高胃組織 GSH-Px、SOD活性，顯著降低MDA、LPO含量，且以治萎防變膠囊大劑量作用顯著，說明治萎防變膠囊具有增加胃黏膜血流量，改善微循環(huán)和提高機體抗氧化酶活性，減輕自由基損傷并抑制脂質(zhì)過氧化物反應，從而拮抗胃黏膜發(fā)生炎癥、萎縮的作用。

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