刁 英 楊智敏 譚兵兵 葛 斌 楊名慧

遵義醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生殖中心(563003)

與傳統(tǒng)體外受精(精卵孵育過夜)不同,短時受精是將精卵共同孵育 2～4h后,即將卵移出受精滴的一種受精方式,對其常規(guī)應用目前仍存在疑義：①短時受精是否會影響受精率與妊娠率;②短時受精并即刻脫顆粒細胞是否增加多原核 PN率等。本研究以在本中心接受體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)治療的患者 271例 316個周期為研究對象,探討上述問題。

1 資料與方法

1.1 研究對象

將 2005年 12月 ～2009年 6月在本中心接受

IVF-ET治療的患者271例 316個周期,隨機分成 3組：①短時受精并即刻脫顆粒細胞組(A組,精卵孵育 2h并即刻脫顆粒細胞)92例 110周期,患者年齡30.8±5.1歲,獲卵 10.8±3.5個;②短時受精并次日晨脫顆粒細胞組(B組,精卵孵育 2h并受精后 18～19h脫顆粒細胞)89例,108個周期,患者年齡30.1±4.9歲,獲卵 11.1±4.0個;③傳統(tǒng)受精組(C組,精卵孵育過夜)90例,98個周期,患者年齡 31.2±4.5歲,獲卵 10.5±3.8個。以上數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析,3組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 控制性超促排卵及取卵 根據(jù)患者年齡、卵巢儲備情況選擇不同的方案。①長方案：采用本中心常規(guī)超排卵方案[1],當有 1個卵泡直徑≥18mm,或 2個以上卵泡直徑≥17mm時,當晚 9時注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000U,36h后在B超引導下陰道取卵。②短方案：在月經(jīng)周期第 2天采用短效曲普瑞林(達必佳)0.1mg降調節(jié),第 3天用卵泡刺激素(FSH)/人絕經(jīng)促性腺激素(HMG)啟動 ,根據(jù)患者年齡、卵巢儲備情況,選擇不同啟動劑量,常規(guī)啟動劑量為 150～225U,根據(jù)卵泡生長情況適時調整藥量。注射 hCG時間與取卵同長方案。

1.2.2 精液準備 手淫法取精于一次性無菌廣口杯中,根據(jù)精液當日情況用密度梯度離心和(或)上游法[2]洗精,置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.2.3 受精及脫顆粒細胞時間和胚胎培養(yǎng) 取卵4～6h后,按精卵(20 000～50 000)：1比例混合法受精。A組：精卵共同孵育 2h后,即脫去卵周圍全部顆粒細胞,將卵轉移至新鮮的已平衡過的受精培養(yǎng)液中;B組：精卵共孵育 2h后,將卵連同周圍顆粒細胞轉移至新鮮已平衡過的受精培養(yǎng)液中,第 2天(精卵共同孵育 18～19h)去掉卵周圍的顆粒細胞;C組：精卵共同孵育過夜(精卵共同孵育 18～19h),第2天去掉卵周圍顆粒細胞。3組卵均于受精 18～19h后轉入卵裂培養(yǎng)基中,在倒置顯微鏡下觀察受精情況。受精卵繼續(xù)培養(yǎng) 48h,觀察胚胎發(fā)育情況,然后選擇優(yōu)質胚胎進行移植。第 3日評價胚胎質量根據(jù)參考文獻[3]的標準進行。胚胎達 6細胞以上,Ⅰ ～Ⅱ級胚胎為優(yōu)質胚胎。

1.2.4 胚胎選擇與移植后處理 取卵后第 3天進行胚胎移植?；颊吣挲g ＜35歲,移植 2個胚胎;年齡 ＞35歲,或≥2個治療周期,移植 3個胚胎。移植后予黃體酮或 hCG支持黃體。移植后 2周測尿hCG,陽性者為生化妊娠。移植后 5周,B超檢查見孕囊及胚芽即診斷為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學方法

3組計量資料采用方差分析,計數(shù)資料采用 χ2檢驗。

2 結果

2.1 受精率、多精受精率、卵裂率和優(yōu)質胚胎率的比較

A組 110個周期共獲卵 1 188個;B組 108個周期,共獲卵 1 198個;C組 98個周期,共獲卵 1 029個。3組相比較,受精率、多精受精率、卵裂率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。優(yōu)質胚胎率 A組、B組均高于 C組(P＜0.01),A組與 B組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 1。

2.2 臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率的比較

A組和 B組的臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于 C組(P＜0.05,P＜0.01),A組與 B組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。流產(chǎn)率各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 1。

表 1 3組 IVF-ET各項數(shù)據(jù)比較

2.3 3組分娩結局

3組出生嬰兒男女性別比例、單胎出生體重及多胎出生體重比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 2。3組均未見畸形新生兒出生,亦無圍生期死亡病例。

3 討論

目前,IVF-ET是治療不育癥最有效的方法之一,但成功率尚不盡如人意。與體內受精時到達受精部位的精子數(shù)量有限(幾條 ～幾百條不等)不同,體外受精時將卵子暴露于較高濃度的精子中(20 000～50 000)長達十多個小時,是否會對卵及其隨后的胚胎發(fā)育產(chǎn)生不良影響?基于此點考慮,1996年 Gianaroli等[4]在前人 Austin[5]及 Yanagimachi[6]等動物實驗的基礎上,首次將精卵孵育時間縮短至 1h,取得了較好的結果。之后又有 Kattera等[7]及 Bungum等[8]等證實了這一結果。本研究結果亦顯示：短時受精無論是即時脫顆粒細胞組還是次日晨脫顆粒細胞組,其受精率、卵裂率、流產(chǎn)率與傳統(tǒng)受精組比較,差異均無統(tǒng)計學意義,而優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率高于后者,究其原因可能有以下幾點：①體內受精時精卵相互作用和受精發(fā)生在性交后 20min內。Gianaroli等[9]發(fā)現(xiàn)：在體外,精子 4h就可以到達卵母細胞的皮質,相互激活,刺激卵母細胞排出第 2極體,形成雌雄原核。Bungum等[8]將受精時間縮短到極致(僅 30s),發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)受精比較受精率無明顯差異;而李濤等[10]采用精卵孵育 10min的超短時受精,也獲得了 65.6%的正常受精率。本研究結果進一步證明：精卵孵育 2h完全能夠滿足受精所需時間。②傳統(tǒng)受精組卵子與高密度精子長時間作用,精子代謝產(chǎn)物堆積,加之脫落的顆粒細胞及死精子等均會消耗培養(yǎng)液的能量,使卵處于一個營養(yǎng)不良的環(huán)境中。另外,顆粒細胞、精子代謝產(chǎn)生的活性氧化物(ROS)可造成不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應,影響卵質膜的流動性,導致卵質膜硬度的變化,這一變化可能影響細胞分裂和損傷細胞功能[4,9]。而且來源于精子的乳酸鹽和 ROS不但對精卵作用產(chǎn)生負面影響,同時也影響透明帶的硬度與厚度[11],從而影響胚胎的孵育與著床,最終影響到 IVF-ET的結局。

表 2 3組分娩結局比較

短時受精并即刻脫顆粒細胞與傳統(tǒng)受精方式比較,除了可以提高優(yōu)質胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率外,還有以下優(yōu)點：①受精 2h脫顆粒細胞后,可以清楚地看見卵是否排出第 1極體,卵周間隙的大小及卵胞漿有無空泡等,從而可以反饋指導臨床注射 hCG的時機是否合適。與此同時筆者還發(fā)現(xiàn)：一些取卵當日(受精后 2h)脫顆粒細胞時為 MⅠ或 GⅤ的卵,次晨可長成 MⅡ(或 MⅠ)的卵卻多不受精,從而解釋了以前受精后 18～19h觀察,部分 MⅡ期卵子未受精的原因之一是因為受精當時卵不成熟。即在短時受精并即刻脫顆粒細胞過程中,可以觀察到卵不成熟或過成熟對受精率和多精受精率的影響。②由于短時受精并即刻脫顆粒細胞后還可以觀察到第 2極體的排出,從而可明確是否需行早期補救 ICSI治療,以避免完全受精失敗的發(fā)生。短時受精并即刻脫顆粒細胞及早期補救 ICSI的使用,將ICSI的指征限定在了無精子癥(采用附睪/睪丸精子)、100%圓頭精子和嚴重卵子異常等情況,因而進一步嚴格控制了 ICSI治療的適應證[12]。

有學者提出：在受精早期脫顆粒細胞的機械操作是否會增加多精受精[13],為此本研究將患者分成了短時受精 2h后即刻脫顆粒細胞與短時受精 2h后,18～19h脫顆粒細胞兩組,分別與傳統(tǒng)受精組進行比較觀察,結果發(fā)現(xiàn) 3組多精受精率沒有差異。可能原因如下：①筆者采用的是直徑為 135～140μm的撥卵針,該針管口光滑,彈性較大,大小適宜,僅需幾次輕柔地吹吸就能很快脫盡顆粒細胞,對卵的影響較小,估計還不至達到引起卵受精異常的程度。②多精受精最主要的原因還在于精子數(shù)量過多和受精卵子本身的質量問題(不成熟或過成熟)[14,15],質量好的卵經(jīng)此操作可能不受影響,而質量差的卵雖經(jīng)如此輕柔的操作仍可能出現(xiàn)異常受精,但也借此淘汰了質量不好的卵形成的胚胎。故筆者認為：只要超排卵方案得當,卵質量好,所加精子密度不過高,短時受精并即刻脫顆粒細胞并不會顯著增加多精受精率;反之,即使不做短時受精并即刻脫顆粒細胞,多精受精率同樣不會低,這在年齡較大或卵募集較多的患者中尤為明顯[16,17]。

綜上所述,筆者認為：短時受精并即刻脫顆粒細胞與傳統(tǒng)受精方式比較,不失為一種有益的改進,且可以幫助臨床判斷注射 hCG的時機是否合適,還使早期補救 ICSI技術成為可能,使 ICSI治療的適應證被進一步嚴格控制。本中心開展此項工作 4年多來,臨床妊娠流產(chǎn)率與傳統(tǒng)組比較并未增多,亦無畸形新生兒出生,出生男女嬰兒性別比例,單胎、多胎新生兒出生體重與傳統(tǒng)組比較亦無差異,故認為此項技術安全有效,值得臨床應用。

1 刁英,楊智敏,譚兵兵,等.短時受精在體外受精 -胚胎移植治療周期中的應用價值[J].中國婦幼保健,2010,25(15)：2104-2106.

2 刁英,楊智敏,譚兵兵.密度梯度離心法加上游法處理精液對精子運動參數(shù)及形態(tài)學的影響[J].新醫(yī)學,2008,39(9)：598-600.

3 莊廣倫.現(xiàn)代輔助生育技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：240-241.

4 Gianaroli L,MagliMC,FerrarettiAP,et al.Reducing the time of sperm-oocyte interaction in human in-vitro fertilization improves the implantation rate[J].Hum Reprod,1996,11(1)：166-171.

5 Austin CR.Observationson the penetration of thesperm into themammalian egg[J].Sci Res,1951,4(8)：581-596.

6 YanagimachiR.In vitrocapacitation ofhamster spermatozoaby follicular fluid[J].Reprod Fertil,1969,18(2)：275-286.

7 Kattera S,Chen C.Short conincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates：a prospective,randomized,controlled study[J].Fertil Steril,2003,80(4)：1017-1021.

8 Bungum M,Bungum L,Humaidan PA.Prospective study,using sibling oocytes,examing the effect of 30 seconds versus 90minutesgamete co-incubation in IVF[J].Hum Reprod,2006,21(2)：518-523.

9 Gianaroli L,Fiorentino A,Magli MC,et al.Prolonged sperm-oocyte exposure and high sperm concentration affect human embryo viability and pregnancy rate[J].Hum Reprod,1996,11(11)：2507-2511.

10 李濤,任姿,張敏芳,等.超短時受精對人類配子體外多精受精發(fā)生率的影響[J].中山大學學報(醫(yī)學版),2007,28(3s)：67-69.

11 Dim feld M,Shiloh H,Bider D,et al.A prospective randomized controlled study of the effect of short coincubation ofgametes during insem ination on zona pellucida thickness[J].Gynecol Endocrinol,2003,17(2)：397-403.

12 孫海翔.早期補救 ICSI的安全性和應用價值[J].生殖醫(yī)學雜志,2009,18(3)：195-197.

13 張微,宋成,成金泉,等.卵子受精早期現(xiàn)象的初步探討[J].生殖醫(yī)學雜志,2009,18(3)：197-202.

14 Flaherty SP,Payne D,Swann NJ,et al.Assessment of fertilization failure and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection(ICSI)[J].Reprod Fertil Dev,1995,7(2)：197-210.

15 莊廣倫.現(xiàn)代輔助生育技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：237-237.

16 黃學鋒,張巍.人類體外受精中的異常受精[J].生殖醫(yī)學雜志,2009,18(3)：184-186.

17 劉德一,Gordon Baker HW.IVF過程受精失敗的預測[J].生殖醫(yī)學雜志,2009,18(3)：202-205.