孫立娟 李曉洲 史云芳 李 巖 岳天孚 張 穎

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院遺傳室(300052)

短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)基因座因在人類基因組中具有分布廣泛、多態(tài)信息含量較高等特點(diǎn)受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,目前被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、群體遺傳學(xué)以及法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。STR基因座的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)具有地域及種族差異[1],而目前大多 STR基因座的相關(guān)數(shù)據(jù)來自高加索人,因此,有必要篩選出本地區(qū)雜合度較高的 STR基因座。據(jù)報(bào)道,21號染色體上唐氏綜合征(DS)關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)或附近的D21S1411和 D21S1413 2個(gè) STR基因座的期望雜合度較高。故本研究選取這 2個(gè)基因座,調(diào)查其在天津市漢族胎兒中的雜合度(Ho)。同時(shí),計(jì)算這 2個(gè)STR基因座的多態(tài)信息含量(PIC)、個(gè)體識別率(DP)和非父排除率(PE)等群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù),為基因診斷及產(chǎn)前基因診斷 DS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

211例產(chǎn)前診斷樣本,包括絨毛組織 49例,羊水細(xì)胞 162例,均采自至天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的妊娠 7～24周婦女,所有樣本經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法證實(shí)為正常核型。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常規(guī)苯酚 -氯仿法提取絨毛組織和羊水細(xì)胞的基因組 DNA。1.2.2引物的選擇與合成 D21S1411和 D21S1413 STR基因座的引物序列參照基因庫(www.GDB.org),由上海生工合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) PCR反應(yīng)體積為 25μl,反應(yīng)體系為：1×PCR緩沖液,2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1 U Taq酶、約 120ng DNA,D21S1411和 D21S1413基因座引物終濃度分別為 0.1μmol/L和 0.3μmol/L。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性 3min;94℃變性 15s,62℃退火延伸 1m in,共 35個(gè)循環(huán);62℃延伸 45min,4℃保存。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),300 V恒壓 1.5h,硝酸銀染色。采用核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析產(chǎn)物,記錄結(jié)果。

1.2.5 建立等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)階梯 挑選樣本中D21S1411和 D21S1413 2個(gè) STR基因座所有的純合子,重新行 PAGE,經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分別測定這 2個(gè) STR基因座各等位基因的分子量,建立 STR基因座各自的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)階梯。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對觀察到的 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型分布進(jìn)行 χ2檢驗(yàn),驗(yàn)證是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。采用Powerstate V12軟件對群體遺傳學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析,獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 PAGE電泳檢測結(jié)果

211例產(chǎn)前診斷樣本均擴(kuò)增成功,經(jīng) PAGE電泳檢測均表現(xiàn)為 1條帶或 2條帶,經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),所有雜合子樣本 2條帶對應(yīng)峰的峰高之比均約為 1：1。見圖 1～3。

圖 3 樣本 5分子量曲線圖 D21S1413 STR基因座出現(xiàn) 1個(gè)峰,表現(xiàn)為純合子,片段大小為 160 bp;D21S1411 STR基因座出現(xiàn) 2個(gè)峰,表現(xiàn)為雜合子,片段大小分別為 303 bp和 287 bp

2.2 D21S1411和 D21S1413基因座等位基因分型階梯

經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析,天津市 211例漢族胎兒中D21S1411基因座共發(fā)現(xiàn)9種等位基因,等位基因片段長度介于 287～319 bp之間,相鄰等位基因間相差 4bp,按片段由小到大依次命名為 1～9。天津市 211例漢族胎兒中 D21S1413基因座共發(fā)現(xiàn) 7種等位基因,等位基因片段長度介于 160～188 bp之間,相鄰等位基因間相差 4bp,按片段由小到大依次命名為 1～7。見圖 4、圖 5。

2.3 D21S1411和 D21S1413基因座的等位基因及基因型分布

在 211例漢族胎兒樣本中,D21S1411基因座共發(fā)現(xiàn) 45種基因型;D21S1413基因座共發(fā)現(xiàn) 28種基因型。天津市漢族胎兒 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型例數(shù)及等位基因頻率見表 1和 2。經(jīng)檢驗(yàn),2個(gè) STR基因座的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律。

表 1 D21S1411各基因型分布及等位基因頻率

表 2 D21S1413各基因型分布及等位基因頻率

2.4 D21S1411和 D21S1413基因座的群體遺傳學(xué)特征

天津市漢族胎兒 D21S1411和 D21S1413基因座的 Ho、PIC、DP、PE等群體遺傳學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果見表3。

表3 D21S1411和D 21S1413基因座的群體遺傳學(xué)特征

3 討論

STR基因座在人類基因組中分布廣泛,平均每隔6～10kb就有一個(gè)。STR基因座多由 2～6個(gè)堿基作為核心單位,核心單位重復(fù)次數(shù)多為 15～30次,核心單位重復(fù)次數(shù)的變化構(gòu)成了 STR基因座的遺傳多態(tài)性,這種重復(fù)次數(shù)的差異在基因傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律[2]。STR基因座片段長度較短,一般為 100～400bp,很容易通過 PCR擴(kuò)增,電泳分型。STR分型具有很高的靈敏度和良好的重復(fù)性,分型結(jié)果穩(wěn)定可靠。由于檢測方法簡便、快速、準(zhǔn)確度高,STR基因座目前已發(fā)展為最主要的個(gè)體識別檢測標(biāo)記,并廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、產(chǎn)前診斷、人口統(tǒng)計(jì)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。

DS是最常見的染色體三體綜合征,在新生兒中的發(fā)病率為 1/600～1/800,主要表現(xiàn)為智力低下及特殊面容。產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn) DS并及時(shí)終止妊娠是降低此類患兒出生的有效手段。目前產(chǎn)前診斷的常用方法是細(xì)胞遺傳學(xué)方法,即通過絨毛取樣、羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺獲得胎兒細(xì)胞,然后進(jìn)行染色體核型分析。該方法已成為產(chǎn)前診斷染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)。但該方法存在步驟繁瑣,均需人工操作等不足,不適合大規(guī)模應(yīng)用。1993年 Mansfield等[3]首次將 STR基因座引入產(chǎn)前診斷染色體數(shù)目異常的研究,通過熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增 21、18號染色體上的 STR基因座,在 13例 DS和18三體綜合征中成功診斷 9例。同一STR基因座在不同個(gè)體可能出現(xiàn)不同長度的等位基因,其可能性的概率與該 STR基因座的雜合度和多態(tài)信息含量密切相關(guān)[4]。正常個(gè)體 STR基因座擴(kuò)增后可表現(xiàn)為 2種情況：一種為純合子,表現(xiàn)為 1條帶;一種為雜合子,表現(xiàn)為 2條帶,定量之比約為 1：1。而三體樣本經(jīng) STR基因座擴(kuò)增后,可表現(xiàn)為以下 3種情況：① 3個(gè)等位基因各不相同,即雜合子時(shí),表現(xiàn)為 3條帶,定量之比約為 1：1：1;②3個(gè)等位基因中有 2個(gè)相同,即半雜合子時(shí),表現(xiàn)為 2條帶,定量之比約為 2：1;③3個(gè)等位基因均相同,即純合子時(shí),出現(xiàn) 1條帶。本實(shí)驗(yàn)中,所有胎兒均為正常核型,電泳均出現(xiàn) 1條帶或 2條帶,核酸/蛋白凝膠圖像管理分析系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)所有雜合子 2條帶對應(yīng)峰的峰高之比均約為 1：1。

為避免因 STR基因座雜合度不高所造成的漏診,應(yīng)盡可能挑選雜合度較高的 STR基因座作為遺傳標(biāo)記,同時(shí)可以聯(lián)合 2個(gè)甚至更多的基因座以提高診斷的準(zhǔn)確率。由于 STR基因座核心序列的重復(fù)次數(shù)在不同地區(qū)及不同種族中會有所不同,甚至差異顯著[1],因而在應(yīng)用 STR-PCR進(jìn)行 DS產(chǎn)前基因診斷之前必須篩選出本地區(qū)本民族雜合度高的 STR基因座作為 21號染色體的遺傳標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)對天津市211例漢族胎兒樣本 D21S1411和 D21S1413基因座進(jìn)行分析。D21S1411基因座發(fā)現(xiàn) 9種等位基因,45種基因型;D21S1413基因座發(fā)現(xiàn) 7種等位基因,28種基因型。2個(gè)基因座基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說明該樣本可反應(yīng)天津市漢族胎兒的遺傳狀況。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道,DP＞0.8,PE＞0.5為多態(tài)信息含量高的標(biāo)準(zhǔn),D21S1411和 D21S1413基因座的DP分別為 0.967和 0.947,PE分別為 0.516和 0.739,2個(gè)基因座均符合上述標(biāo)準(zhǔn),可見這 2個(gè)基因座在天津漢族胎兒中多態(tài)信息含量較高,可用于染色體數(shù)目異常的研究。

本實(shí)驗(yàn)選用非變性 PAGE和銀染法對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。PAGE是一種常用的 DNA檢測方法,凝膠化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,樣品用量少,其靈敏度較高。PAGE集濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)為一體,所以電泳分辨率較高,尤其適用于對較小的 DNA片段的分析(5～500bp)。而采用銀染法染色,可以提高聚丙烯酰胺凝膠 DNA染色的靈敏度。該方法成本低,使用的儀器設(shè)備簡單,結(jié)果可以直接用肉眼觀察,易于掌握,尤其適用于廣大基層醫(yī)院。但應(yīng)用 PAGE電泳和銀染法檢測 STR基因座擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí),常在目標(biāo)片段條帶附近發(fā)現(xiàn)一些染色較淺的影子帶。這些非特異性條帶在一定程度上影響了分析帶型的準(zhǔn)確性,甚至可能對等位基因的判讀產(chǎn)生影響。如何消除這些影子帶是學(xué)者們一直致力研究的問題,但迄今為止尚無統(tǒng)一的認(rèn)識和令人滿意的方法。關(guān)于影子帶產(chǎn)生的機(jī)理,Murray等[6]在研究 CA二核苷酸重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增時(shí)認(rèn)為,CA重復(fù)序列區(qū)中 2bp的隨機(jī)缺失或增加所導(dǎo)致的影子帶可能是 DNA鏈在復(fù)制過程中滑動所致,并曾設(shè)想一種高效的 DNA聚合酶可以減少影子帶的產(chǎn)生。武輝等[7]在三核苷酸重復(fù)序列的PCR擴(kuò)增中,用普通 Taq DNA聚合酶與具有 3′→5′外切活性的 pwo DNA聚合酶相混合,可以消除影子帶,在一定程度上證實(shí)了 Murray等的觀點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中體會到,對于非變性 PAGE而言,恒定的電壓和電泳溫度是關(guān)鍵,因?yàn)闇囟瓤芍苯佑绊?DNA分子內(nèi)部穩(wěn)定力的形成及其所決定的分子構(gòu)像,從而影響條帶的檢出。室溫電泳適用于大多數(shù)情況,但由于電泳時(shí),尤其是高電壓下電泳時(shí),凝膠溫度會升高,有可能對 STR基因座擴(kuò)增產(chǎn)物的正確檢出造成不良影響。針對上述情況,通?？刹扇p少凝膠厚度、降低電壓、空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等措施來避免影子帶的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)采用了控制電泳溫度,并選用 150V低電壓等措施來減少影子帶的出現(xiàn)。

隨著 DS產(chǎn)前篩查的普及,因篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)而行產(chǎn)前診斷的妊娠婦女日益增多,傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法已不能滿足臨床產(chǎn)前診斷的需要。STRPCR技術(shù)用于產(chǎn)前診斷染色體數(shù)目異常,能夠與細(xì)胞遺傳學(xué)方法互補(bǔ),對于臨床而言是一種較好的選擇。

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