鄭發(fā)著 穆芳 張利 沈鴻彬

Ki67、CyclinD1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

鄭發(fā)著 穆芳 張利 沈鴻彬

目的探討Ki67、CyclinD1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)意義及與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)60例食管鱗狀細(xì)胞癌及食管正常組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達(dá)情況，并檢測(cè)食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)與不同臨床參數(shù)之間的關(guān)系。FCM方法檢測(cè)食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)到食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常食管組織(P＜0.05)。食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)水平與食管鱗癌細(xì)胞分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌浸潤(rùn)深度有關(guān)(P＜0.05)，與患者的性別及年齡無關(guān)(P＞0.05)。食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性。結(jié)論 Ki67、CyclinD1蛋白在食管癌組織中的高表達(dá)可能參與了食管癌的發(fā)生與發(fā)展，其高表達(dá)使細(xì)胞具有旺盛增殖能力，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。聯(lián)合檢測(cè)Ki67、CyclinD1可作為食管癌診斷指標(biāo)。

流式細(xì)胞術(shù);食管鱗狀細(xì)胞癌;Ki67;CyclinD1

食管癌是較常見的惡性腫瘤，我國(guó)是食管癌的高發(fā)區(qū)，尤其在河北的磁縣和河南的林縣發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響了人們的生命健康，目前食管癌的發(fā)病機(jī)制仍為闡明，研究食管癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)食管癌早期診斷具有重要的意義。細(xì)胞周期的紊亂與腫瘤的發(fā)生具有密切的關(guān)系，Ki67及CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控因子［1-4］，可以調(diào)控細(xì)胞周期從G1期向S期過渡，從而使細(xì)胞呈現(xiàn)旺盛增殖能力，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［5，6］。本實(shí)驗(yàn)主要研究食管癌組織中Ki67、CyclinD1表達(dá)意義及與食管癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2003年1月至2004年12月食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本120例，所有患者術(shù)前未接受過化療和放療。每例標(biāo)本分別取癌組織及手術(shù)切緣正常食管黏膜(距癌邊緣5 cm以上)。每個(gè)組織分為兩份，分別固定于4%多聚甲醛(用于HE病理診斷)和70%乙醇(用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè))。所有標(biāo)本臨床病理資料完整，全部經(jīng)病理檢查確診。從中選出60例食管鱗狀細(xì)胞癌(B組)和正常食管黏膜組織(A組)，用于FCM的檢測(cè)，男40例，女20例;年齡38～83歲，平均年齡(58±7)歲。食管鱗癌組織中45例為高中分化鱗癌，15例為低分化鱗癌;42例侵及纖維膜，18例未達(dá)到纖維膜;19例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，41例未轉(zhuǎn)移。

1.2 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman Coulter公司;鼠抗人Ki67、CyclinD1抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購自Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)體組織單細(xì)胞懸液的制備:網(wǎng)搓法制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸浮計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml時(shí)，此懸浮液為單分散細(xì)胞懸液。

1.3.2 Ki67、CyclinD1蛋白的免疫熒光標(biāo)記:取單細(xì)胞懸液0.1 ml(含1×106個(gè)細(xì)胞)，分別加入1∶100稀釋的鼠抗人Ki67、CyclinD1抗體0.1 ml，室溫放置30 min，加入PBS 10 ml洗滌一次，1 000轉(zhuǎn)，5 min低速離心，棄上清，分別加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液 100 μl，避光室溫放置 30 min，加入 PBS 10 ml 1 000轉(zhuǎn)，5 min低速離心，棄上清以除去未結(jié)合的熒光二抗，上機(jī)檢測(cè)前加入PBS 1.0 ml，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蛋白表達(dá)方式:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)量以平均熒光強(qiáng)度(Mean Fluorescence Intensity)表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析采用Peason相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同食管組織中Ki67蛋白的表達(dá)情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，Ki67蛋白在食管癌組織中的表達(dá)顯著高于食管正常組織(P ＜0.05)。見表1，圖1。

2.2 不同食管組織中CyclinD1蛋白的表達(dá)情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到CyclinD1蛋白在食管癌組織中的表達(dá)顯著高于食管正常組織(P ＜0.05)。見表2，圖2。

2.3 食管癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 Ki67、CyclinD1蛋白表達(dá)量在低分化者、浸潤(rùn)深度達(dá)到纖維膜者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于中高分化者、浸潤(rùn)深度未達(dá)到纖維膜者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。年齡和性別之間表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Ki67蛋白在不同食管組織中的表達(dá)

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同食管組織中Ki67蛋白的表達(dá)

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CyclinD1蛋白在不同食管組織中的表達(dá)n=60，±s

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CyclinD1蛋白在不同食管組織中的表達(dá)n=60，±s

組別 CyclinD1 t值 P值A(chǔ)組368±26 B組401±29 6.511 0.000

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同食管組織中CyclinD1蛋白的表達(dá)

表3 食管鱗癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達(dá)與不同臨床參數(shù)之間的關(guān)系±s

表3 食管鱗癌組織中Ki67、CyclinD1蛋白的表達(dá)與不同臨床參數(shù)之間的關(guān)系±s

臨床病理特征 Ki67 P值 CyclinD1 P值年齡(歲)446±26 0.000 392±27 0.000≤60(n=35) 457±23 400±30＞60(n=25) 459±36 0.778 403±28 0.682性別男(n=40) 459±25 402±29女(n=20) 455±36 0.659 400±29 0.847分化程度高/中(n=45) 451±26 395±24低(n=15) 479±26 0.001 419±37 0.005浸潤(rùn)深度纖維膜(n=42) 463±26 409±22未達(dá)到纖維膜(n=18) 446±33 0.032 383±35 0.008淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性(n=19) 483±14 422±22陰性(n=41)

2.4 食管癌組織中Ki67與CyclinD1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，食管癌組織中Ki67蛋白表達(dá)與CyclinD1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù) =0.275，P=0.034)。

3 討論

食管癌是我國(guó)較常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率高，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康，闡明食管癌的發(fā)生機(jī)制對(duì)食管癌的早期診斷具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期紊亂能夠?qū)е履[瘤的發(fā)生［7，8］，是腫瘤發(fā)生的促使因素。Ki67和CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子。

Ki67是一種核增殖抗原［9］，存在于細(xì)胞周期的 G1、S、G2、M期，G1后期開始出現(xiàn)，在S期和G2期逐漸升高，M期達(dá)到高峰，但G0期無表達(dá)。而且還發(fā)現(xiàn)Ki67在S期聚集，尤其是在后半期表達(dá)率明顯增高，故Ki67只表達(dá)于增殖期細(xì)胞，而不表達(dá)于靜止期細(xì)胞。Ki67表達(dá)的高低反映了細(xì)胞增殖狀態(tài)，是目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一。Ki67在細(xì)胞中的高表達(dá)可以使細(xì)胞具有增值旺盛的能力，促使腫瘤的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)食管癌組織中Ki67蛋白的表達(dá)顯著高于食管正常組織，Ki67的高表達(dá)可能參與了食管癌的發(fā)生。同時(shí)檢測(cè)了食管癌組織中Ki67的表達(dá)與不同臨床參數(shù)之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Ki67表達(dá)量在低分化者、浸潤(rùn)深度達(dá)到纖維膜者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于中高分化者、浸潤(rùn)深度未達(dá)到纖維膜者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示Ki67可能參與了食管癌惡性度轉(zhuǎn)化過程，可作為食管癌惡性度及預(yù)后判斷的指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞周期進(jìn)程中，CyclinD1主要功能是調(diào)控細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入 S期［10］，促進(jìn)細(xì)胞增殖，當(dāng)CyclinD1蛋白在細(xì)胞中表達(dá)異常增高時(shí)，將引起細(xì)胞增殖周期失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到食管癌組織中CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著高于食管正常組織，CyclinD1的高表達(dá)可促使細(xì)胞周期從G1期過渡至S期，使細(xì)胞呈現(xiàn)旺盛的增值能力，參與了食管癌的發(fā)生。同時(shí)檢測(cè)了食管癌組織中CyclinD1表達(dá)水平在低分化者、浸潤(rùn)深度達(dá)到纖維膜者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者顯著高于中高分化者、浸潤(rùn)深度未達(dá)到纖維膜者、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示CyclinD1可能參與了食管癌惡性度轉(zhuǎn)化過程，可作為食管癌惡性度和預(yù)后判斷的指標(biāo)。而且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，食管癌組織中Ki67蛋白的表達(dá)與CyclinD1蛋白表達(dá)具有正相關(guān)性。腫瘤發(fā)生是多基因、多因素引起的，Ki67、CyclinD1在細(xì)胞中的異常表達(dá)可能共同參與了食管癌的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，提示Ki67與CyclinD1蛋白在食管組織細(xì)胞中的異常高表達(dá)可能參與了食管癌發(fā)生及發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)對(duì)食管癌的早期診斷具有一定的臨床意義，而且為食管癌的靶向治療提供新的研究方向。

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Expression and significance of Ki67 and CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma

ZHENG Fazhu，MU Fang，ZHANG Li，et al．Department of Surgery，Handan People’s Hospital，Hebei，Handan 056001，China

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Ki67 and CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma，and to explore the correlation between the expressions of Ki67，CyclinD1 protein and pathogenesis as well as progression of esophageal squamous cell carcinoma.MethodsThe levels of Ki67，CyclinD1 protein expression in 60 cases of normal esophageal mucosa and esophageal carcinoma tissues were detected by flow cytometry.The correlation between the expression of Ki67，CyclinD1 protein and clinicopathological characteristics of esophageal squamous cell carcinoma was analyzed.ResultsThe expression levels of Ki67，CyclinD1 protein in esophageal squamous cell carcinoma were significantly higher than those in normal esophageal tissues(P ＜0.05).The expression levels of Ki67，CyclinD1 protein in esophageal cancer were closely correlated with the degrees of differentiation，metastasis of lymph node and the invasive depth of the tumor(P ＜0.05).There was no significant correlation between Ki67，CyclinD1 protein expression in esophageal cancer and the patients'gender，age(P ＞0.05).There was a positive correlation between ki67 protein expression and CyclinD1 protein expression in esophageal cancer.ConclusionThe high-expression of Ki67 and CyclinD1 may be involved in the pathogenesis and advancement of esophageal squamous cell carcinoma，which may induce the high proliferation of cells，then result in the tumorigenesis.The combination detection of Ki67 and cyclinD1 can be used as valuable diagnosis indexes for esophageal carcinoma.

flow cytometry;esophageal squamous cell carcinoma;Ki67;cyclinD1

R 735.1

A

1002-7386(2011)09-1293-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．004

056001 河北省邯鄲市人民醫(yī)院外科

沈鴻彬，056001 河北省邯鄲市人民醫(yī)院外科;E-mail:laoyindy1010@163.com

2011-02-18)

·論著·