喻昌利 李林 戈艷蕾 王紅陽

羅格列酮對大鼠肺纖維化細胞模型干預治療的療效觀察

喻昌利 李林 戈艷蕾 王紅陽

目的采用轉化生長因子(TGF-β1)誘導大鼠肺成纖維細胞，給予羅格列酮干預，明確其對大鼠肺纖維化的影響。方法 以組織貼塊法培養(yǎng)肺成纖維細胞，分為0.4%血清對照組(空白對照組)、TGF-β1模型組(模型組)、TGF-β1+不同濃度羅格列酮干預組(干預組)，分別檢測大鼠肺纖維化細胞代謝活性及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成情況。結果 不同濃度羅格列酮干預組OD值與模型組比較都有所下降(P＜0.05)，其中羅格列酮濃度在10 μmol/L時OD值與模型組比較下降最為明顯，不同羅格列酮濃度組間OD值差異無顯著性(P＞0.05)。10 μmol/L羅格列酮干預組與模型組相比較，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達下降，差異具有顯著性(P＜0.05)。結論 羅格列酮可以抑制TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞增殖和Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成。

肺纖維化;羅格列酮;過氧化物體增殖活化受體-γ;TGF-β1;大鼠;療效

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 出生1～2 d的Wistar大鼠(由河北聯(lián)合大學實驗動物中心提供)20只;小鼠抗大鼠Ⅰ型和Ⅲ型膠原單克隆抗體(Sigma產品);羊抗小鼠二抗、DAB顯色試劑盒(博士德生物有限公司);轉化生長因子(TGF-β1)(peprotech產品);馬來酸羅格列酮(葛蘭素史克，購自醫(yī)藥公司)。

1.2 方法 取出Wistar乳鼠肺組織，將肺組織剪碎成1 mm3大小，接種于培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)的細胞調整同步化后，使細胞靜止于G0/G1期，取第四代細胞接種于培養(yǎng)板，分為3組:(1)空白對照組:以0.4%血清濃度DMEM為基礎培養(yǎng)液，培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞。(2)模型組:0.4%血清培養(yǎng)條件下，給予TGF-β1(5 ng/ml)孵育細胞。(3)干預組:0.4%血清培養(yǎng)條件下，分別同時給予不同濃度羅格列酮(10、20、50、100 μmol/L)，預孵育30 min后給予TGF-β1(5 ng/ml)孵育細胞。按照以上實驗分組分別加入相應試劑，刺激48 h后，MTT法檢測細胞代謝活性及免疫細胞化學常規(guī)染色方法檢測Ⅰ型與Ⅲ型膠原，經自動圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

1.3統(tǒng)計學分析應用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s

表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺成纖維細胞的形態(tài)學特征 顯微鏡下觀察大鼠肺成纖維細胞呈梭形，胞質透明，胞核較大，可見核仁。細胞伸出多個突起，并連接成網狀，在局部融合成片，細胞密集時呈放射狀分布，TGF-β1誘導的大鼠肺纖維化細胞模型建立成功。

2.2 羅格列酮對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞增殖的調節(jié)作用 干預組隨著羅格列酮劑量(10、20、50、100 μmol/L)的增加，反映細胞代謝活性的OD值分別是模型組的80.6%，85.1%，87.2%，89.8%和94.9%，與模型組比較均有所下降，不同羅格列酮濃度組與模型組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中當羅格列酮濃度在10 μmol/L時干預組OD值與模型組比較下降最為明顯，但不同羅格列酮濃度組間OD值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 羅格列酮對大鼠肺成纖維細胞增殖抑制的劑量關系

2.3 免疫細胞化學法測定肺成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達情況 當羅格列酮濃度在10 μmol/L時反映細胞代謝活性OD值與模型組比較下降最為明顯，選擇羅格列酮濃度10 μmol/L進行干預，與模型組相比較，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 3組大鼠肺纖維化細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原表達情況

3 討論

肺纖維化是在各種病因下導致的肺間質纖維增生。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以調控細胞的增生、分化、凋亡、黏附、運動以及產生某些促纖維化細胞因子［3］，是目前最強的促進肺成纖維細胞增殖和分泌細胞外基質的刺激因子，在肺纖維化疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［4］。

目前肺間質纖維化尚無有效藥物治療。研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ通過連接到目標基因增強子序列上的過氧化物體增殖反應元件，可以調節(jié)生殖、代謝、生長和免疫反應的基因表達［5，6］。有研究發(fā)現(xiàn)對肺纖維化大鼠模型應用PPARγ激動劑治療，可以使肺纖維化緩解，提示PPARγ激動劑對肺纖維存在一定治療作用［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)MTT法檢測干預組OD值較模型組降低，提示羅格列酮干預對大鼠肺成纖維細胞增殖有抑制作用，其中當羅格列酮濃度在10 μmol/L時，干預組OD值與模型組比較下降最為明顯，但不同羅格列酮濃度組間OD值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。同時在檢測大鼠肺成纖維細胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達發(fā)現(xiàn)，予羅格列酮干預后，Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達量下降，顯示羅格列酮能夠抑制TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達，在一定程度上提示羅格列酮有拮抗肺纖維化的作用。表明羅格列酮對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞增殖有抑制作用，這為肺間質纖維化的防治提供了新的思路。

1 曹殿鳳，尚波.轉換生長因子-β1及其基因多態(tài)性在塵肺領域的研究進展.中國工醫(yī)學雜志，2008，21:111-113.

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3 Necela BM，Su W，Thompson EA.Toll-like receptor 4 mediates cross-talk between PPARγ and NF-kappaB in macrophages.Immunology，2008，125:344-358.

4 Reddy RC.Immunomodulatory role of PPARγ in alveolar macrophages.Investig Med，2008，562:522-527.

5 梁鳴，李雯，顧海峪.羅格列酮對博萊霉素誘導大鼠肺纖維化的影響.廣東醫(yī)學，2007，28:195-196.

6 Madtesdk A，Elstonal S，Hachmanrl J，et al.Transforming growth factoralpha deficiency reduced pulmonary fibrosis in transgenic mice.Am J Res pir Cell Mol Biol，1999，20:924-934.

7 李晶，李忠，莫寶慶.ERK5 MAPK信號轉導通路研究進展.醫(yī)學分子生物學雜志，2005，2:288-291.

Therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell

YU Changli，LI Lin，GE Yanlei，et al．Department of Respiratory Medicine，Hebei United University，Hebei，Tangshan 063000，China

ObjectiveTo observe the therapeutic effect of rosiglitazone on the models of rat pulmonary fibrosis cell by inducing rat lung fibroblast with transforming growth factor(TGF-β1)，then giving rosiglitazone intervention therapy.MethodsThe lung fibroblasts were cultured with tissue paste-block method，which were divided into 0.4%serum control group(blank control group)，TGF-β1 model group(model group)，TGF-β1+different concentration rosiglitazone treatment groups(intervention group)，and immunohistochemical staining was used to detect the metabolic activity of pulmonary fibrosis cell and the synthesis condition of typeⅠ，Ⅲ collagen.ResultsCompared with the model group，different concentrations of rosiglitazone groups’OD values declined(P＜0.05)，and 10μmol/L rosiglitazone group had the most obvious result，different concentration of rosiglitazone was no significant difference in OD values(P ＞0.05).10 mol/L rosiglitazone group decreased typeⅠandⅢcollagen expression(P＜0.05).ConclusionRosiglitazone can inhibit the proliferation of rat lung fibroblast induced by TGF-β1 and can inhibit the synthesis of typeⅠ，Ⅲ collagen.

pulmonary fibrosis;rosiglitazone;PPAR-γ;TGF-β1;rats;effect近年來研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ激動劑——羅格列酮，可以通過負反饋調節(jié)T細胞、巨噬細胞及有關免疫調節(jié)細胞的活化、增生及炎性反應基因的轉錄，從而具有抗纖維化作用［1］。目前其抗纖維化作用的研究主要集中在肝臟、心臟和腎間質［2，3］，對抗肺間質纖維化的研究較少。本實驗探討羅格列酮對肺間質是否存在抗纖維化作用，為肺間質纖維化的防治提供新思路。

R 563

A

1002-7386(2011)09-1299-02

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．006

063000 河北省唐山市，河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院呼吸內科

2011-01-06)

·論著·