羅寶正,王連想,薄清如,王愛(ài)民,徐海聶,黃好興

(1.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局國(guó)家外來(lái)病檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東珠海519015;2.廣東溫氏食品集團(tuán)有限公司,廣東新興527300;3.珠海市農(nóng)業(yè)局,廣東珠海519000)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱“豬藍(lán)耳病”,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的高度傳染性免疫抑制疾病,以成年豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎,以及仔豬呼吸異常為特征,常常繼發(fā)其他病原感染[1]。自1987年美國(guó)報(bào)道以來(lái),該病已逐漸成為困擾世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病,給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失,也是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬病控制的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。我國(guó)1996年首次報(bào)道PRRS,關(guān)于該病發(fā)生、流行以及研究的報(bào)告日趨增多[3-5]。PRRSV分為美洲型和歐洲型,截止目前我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)由歐洲型毒株感染引起的豬藍(lán)耳病。2006年5月份以來(lái),在我國(guó)多個(gè)省份暴發(fā)流行并造成仔豬大量死亡的豬“高熱病”疫情,經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病原分離鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)等科技攻關(guān),證實(shí)了其病原為美洲型PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)[6]。目前,該變異毒株已廣泛存在于我國(guó)多個(gè)省份。

傳統(tǒng)的PRRS診斷方法有病毒分離、ELISA、免疫過(guò)氧化酶單層試驗(yàn)、間接熒光試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)等,然而傳統(tǒng)診斷方法無(wú)法區(qū)分PRRSV和PRRSV變異株,因而急需研究出快速、靈敏、便捷的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。熒光RT-PCR作為一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)比普通RT-PCR具有更多優(yōu)勢(shì)。本研究擬建立美洲型PRRSV通用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR及其變異株(NSP2 1594～1680缺失)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法,期望為科學(xué)監(jiān)測(cè)和綜合防控PRRS提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 美洲型PRRSV Ch-1a株為PRRSV弱毒疫苗株,上海海利生物藥品有限公司;ATCC VR-2332株為PRRSV弱毒疫苗株,勃林格殷格翰動(dòng)物保健(美國(guó))有限公司。

美洲型PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失):GDBY-3株為第3代細(xì)胞分離變異株(NSP2 1594～1680缺失),廣東省動(dòng)物防疫監(jiān)督總所分離鑒定保存;JX-A1株為PRRSV滅活疫苗株,廣東省肇慶大華農(nóng)生物技術(shù)有限公司。

豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型均為細(xì)胞毒,由珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局保存。

1.2 方法

1.2.1 TCID50測(cè)定 GDBY-3株為第3代細(xì)胞分離株,其TCID50測(cè)定按Reed Muench法進(jìn)行。

1.2.2 RNA的提取 病毒、樣品總RNA提取用Mrcgene公司的T rizol Reagent Kit,按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用20 μ L DEPC H2O溶解提取的RNA。取2 μ L用于RT-PCR反應(yīng)。

1.2.3 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成 從GenBank中獲取多個(gè)美洲型PRRSV M基因序列和病毒變異株(NSP2 1594～1680缺失株)NSP2區(qū)域基因序列,用CLUSTAL X進(jìn)行序列分析,找到保守片段用Primer Express 2.0進(jìn)行特異性引物、探針設(shè)計(jì)。引物和探針均在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。探針5′端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)FAM,3′端標(biāo)記泯滅基團(tuán)TAMRA。PRRSV特異性引物和探針:上游引物5′-GAT TGCGGCAAATGATAACCA-3′;下游引物5′-AACCCGGGCACCAATGT-3′;Taqman探針FAM-ATT TGTCGTCCGGCGTCCCG-TAMRA。PRRSV變異株引物和探針:上游引物5′-CAGGATGAGCCTCTGGATT TG-3′;下游引物5′-CCTCCAGGATGCCCAT GTT-3′;Taqman探針FAM-CGGAATATGAGGCT TTCCCCCTAGCATAMRA。其中,針對(duì)M基因的引物、探針用于建立美洲型PRRSV通用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法,針對(duì)NSP2基因的引物探針用于建立PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失株)實(shí)時(shí)熒光RTPCR檢測(cè)方法。

1.2.4 RT-PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序 使用TAKARA公司一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,每條引物終濃度為0.2 mmol/L。反應(yīng)條件為50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性2 min;然后94℃10 s,58℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán);最后72℃7 min延伸。取RT-PCR產(chǎn)物5 μ L在15 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存結(jié)果。將擴(kuò)增到的目的基因片段采用T-A克隆方案克隆至pMD18-T載體。使用QIAGEN公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒抽提重組質(zhì)粒(按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行),送廣州英駿生物公司測(cè)序。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 對(duì)兩套引物、探針配制的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR,反應(yīng)條件均為42℃30 min;92℃2 min;然后92℃10 s,55℃30 s,40個(gè)循環(huán);反應(yīng)在Lightcycler實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。每條引物終濃度為0.4 mmol/L,探針濃度為0.2 mmol/L。反應(yīng)體系使用深圳匹基公司的顆粒酶和珠?？频巧锛夹g(shù)有限公司的TaqDNA聚合酶配制,每個(gè)反應(yīng)使用1/4顆粒酶和2 U TaqDNA聚合酶。加入DEPC H2O將每個(gè)反應(yīng)體系補(bǔ)足到25 μ L。

1.2.6 特異性檢測(cè) 提取PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)和變異PRRSV毒株(GDBY-3株、JX-A1株)、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒等病毒RNA,提取豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA,用上述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證其特異性。

1.2.7 敏感性檢測(cè) 對(duì)GDBY-3分離株進(jìn)行10倍倍比稀釋,每個(gè)稀釋度200 μ L提取病毒RNA為模板,配制反應(yīng)體系在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上檢測(cè)進(jìn)行敏感性試驗(yàn),檢測(cè)到的最低濃度作為該方法的靈敏度。

1.2.8 臨床可疑樣品檢測(cè) 建立的兩種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)24份臨床可疑樣品進(jìn)行檢測(cè),包括豬肺、淋巴結(jié)、組織樣品和血液。同時(shí)用病毒分離方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR反應(yīng)及克隆測(cè)序

根據(jù)引物的設(shè)定,PRRSV RT-PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為81 bp,PRRSV變異株RT-PCR產(chǎn)物91 bp。RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì),與目的片段序列基本一致。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的建立

2.2.1 特異性試驗(yàn) 利用設(shè)計(jì)的兩套引物、探針配制反應(yīng)體系,提取PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)和PRRSV變異株(GDBY-3株、JXA1株)RNA進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)后,PRRSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法對(duì)以上4個(gè)病毒株的檢測(cè)都呈陽(yáng)性,PRSSV變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法只對(duì)變異株P(guān)RRSV毒株(GDBY-3株、JX-A1株)檢測(cè)陽(yáng)性,PRRSV弱毒疫苗株(Ch-1a株、ATCC VR-2332株)檢測(cè)都是陰性,因此可以有效區(qū)分PRRSV與PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)。豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型和空白對(duì)照都無(wú)實(shí)時(shí)熒光值增長(zhǎng)。顯示該檢測(cè)方法具有良好的特異性,能特異性的檢測(cè)PRRSV及其變異株(NSP2 1594～1680缺失)(圖1和圖2)。

圖1 PRRSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法特異性擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of specificity for PRRSV

圖2 PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法特異性 擴(kuò)增曲線 Fig.2 Real-time PCR amplification curve of specificity for variant PRRSV

2.2.2 靈敏性試驗(yàn) GDBY-3株毒價(jià)經(jīng)測(cè)定為103.67TCID50/0.2 mL,兩種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法都能檢測(cè)到104倍稀釋的病毒培養(yǎng)液,相當(dāng)于0.47個(gè)TCID50,105倍之后的病毒稀釋液檢測(cè)全部陰性(圖3和圖4)。

2.3 臨床可疑樣品檢測(cè)及與病毒分離方法的比較

對(duì)24個(gè)臨床可疑樣品進(jìn)行病毒分離,分離到21株P(guān)RRSV,經(jīng)NSP2序列測(cè)定均為PRSSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)。本研究建立的方法均檢測(cè)到21份陽(yáng)性,與病毒分離方法檢測(cè)結(jié)果一致(圖5和圖6)。

圖3 PRRSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度擴(kuò)增曲線圖Fig.3 Sensitivity amplification curve of PRRSV real-time RT-PCR

圖4 PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度 擴(kuò)增曲線圖 Fig.4 Sensitivity amplification curve of PRRSV variant strain real-time RT-PCR

圖5 PRRSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR臨床樣品擴(kuò)增曲線Fig.5 Clinical sample amplification curve of PRRSV real-time RT-PCR

圖6 PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR臨床樣品 擴(kuò)增曲線 Fig.6 Clinical sample amplification curve of PRRSV variant strain real-time RT-PCR

3 討論

我國(guó)于1996年首次分離到PRRSV,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)此病在國(guó)內(nèi)流行廣泛,并且都為美洲型PRRSV引起。國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于PRRSV NSP2氨基酸缺失的報(bào)道[7-8],但出現(xiàn)兩個(gè)不連續(xù)位點(diǎn)缺失30個(gè)氨基酸的毒株,且在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛流行并造成重大損失的高致病性PRRSV,2006年在我國(guó)屬于首次發(fā)現(xiàn)。PRRSV的NSP2是各毒株間差異較大的一個(gè)編碼區(qū),具有種特異性,美洲型和歐洲型PRRSV的氨基酸序列同源性只有32%,NSP2與PRRSV對(duì)細(xì)胞或組織的嗜性有關(guān),在遺傳關(guān)系很近的毒株間也可有較大差異。NSP2基因序列的缺失是2006年我國(guó)暴發(fā)所謂“高熱病”以來(lái)豬場(chǎng)PRRSV分離株的一個(gè)顯著特征,且不同省市豬場(chǎng)流行的PRRSV相互之間高度同源,這些基因的缺失和結(jié)構(gòu)蛋白基因序列的突變,可能與毒力的改變具有非常重要的相關(guān)性[9]。

郝曉芳等[10]曾建立了高致病性PRRSV RTPCR鑒定技術(shù)。然而,該方法的靈敏度方面與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)比較有明顯的差距。范忠軍等[11]建立了針對(duì)PRRSV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù),并具有良好的效果,其主要是針對(duì)PRRSV基因組中保守的M蛋白基因,而M蛋白基因具有很強(qiáng)的群特異性,可以作為群特異性檢測(cè)的靶基因,無(wú)法區(qū)分傳統(tǒng)型PRRSV和PRRSV變異株。羅長(zhǎng)保等[12]建立PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)技術(shù),其檢測(cè)的區(qū)域是NSP2基因,雖然國(guó)內(nèi)暫時(shí)分離到的PRRSV變異株(NSP2 1594～1680缺失)在NSP2同源性較高,但NSP2畢竟具有高突變性,不斷出現(xiàn)的新毒株容易在NSP2發(fā)生突變,而造成漏檢。本研究建立了同時(shí)針對(duì)PRRSV M基因和NSP2基因的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法,其中針對(duì)NSP2基因的診斷方法可區(qū)分美洲型PRRSV和PRRSV變異株(NSP2 1594-1680缺失),針對(duì)保守的M基因的引物設(shè)計(jì)策略,還可有效防止因NSP2區(qū)突變而造成的漏檢。

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