馬果果 張吉翔

腫瘤屬于基因疾病，其生物學(xué)基礎(chǔ)是基因的異常。DNA損傷若不能得到及時有效地修復(fù)，積累到一定程度可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性升高，從而引起細(xì)胞增殖和分化失控，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。XPD是哺乳動物基本轉(zhuǎn)錄因子ⅡH（TFⅡH）的核心亞單位之一，參與基因轉(zhuǎn)錄、核苷酸切除修復(fù)及細(xì)胞周期調(diào)控，并影響多種抑癌基因和癌基因的表達(dá)[2]。XPD過表達(dá)對腫瘤生長的影響已成為近年來研究的熱點。本研究將野生型XPD基因轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞HepG2中，并檢測XPD、p52及p21的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞的生物學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞HepG2購自美國模式菌種收集中心。重組質(zhì)粒pEGFP-N2-XPD（XPD質(zhì)粒）及胎中血清Fetal Bovin Serum（pEGFP-N2，N2質(zhì)粒）由本實驗室構(gòu)建[3]。MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清（FBS）購自澳大利亞Hy?clone公司。Lipofectamine 2000TM、Trizol購自美國Invitrogen公司。M-MLV Reverse Transcriptase、Rnasin、dNTP、Oligo（dT）及N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）購自美國Promega公司。PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。Tag PCR Master?Mix、Markr I購自北京天根生化科技有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸员本┢绽R基因技術(shù)有限公司。單克隆抗體XPD、p52、p21購自美國Santa Cruz公司。異丙醇、氯仿、無水乙醇購自上海振華化工廠。DMSO（Dimethyl sulfide）、DEPC（Diethyl pyrocarbonate）購自美國Ameresco公司。Tris購自美國Roche公司。MTT購自上海普飛生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d傳代1次。根據(jù)細(xì)胞處理情況的不同分為3組：肝癌細(xì)胞無轉(zhuǎn)染空白對照組HepG2、空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2-pEGFP-N2組（N2組）以及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2-pEGFP-N2-XPD組（XPD組）。以2×105/孔的密度鋪于6孔板內(nèi)，24 h細(xì)胞鋪滿50%～80%，用脂質(zhì)體2000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA。PCR擴(kuò)增XPD、p52以及p21。根據(jù)GenBank上公布的人類XPD、p52及p21 mRNA序列，應(yīng)用Primer Primier 5軟件設(shè)計引物，由上海生工生物工程公司合成，見表1。同一標(biāo)本擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參照。PCR通過94℃預(yù)變性5 min，94℃45 s，54℃60 s，72℃45 s，35個循環(huán)后72℃終末延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳（含5 mg/L溴化乙錠）后，在紫外燈下觀察結(jié)果。通過Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司）讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的XPD、p52及p21的密度掃描值，獲得其mRNA相對表達(dá)量。

表1 XPD、p52及p21引物序列

1.3 Western blot檢測 使用蛋白抽提液分別提取3組細(xì)胞的總蛋白，全自動生化分析儀（Beckman，USA）測定蛋白濃度。取同量蛋白上樣于8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，繼而轉(zhuǎn)移蛋白于硝酸纖維素膜；將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中4℃封閉過夜，加封閉液稀釋的一抗（1∶200）過夜，用TBST洗膜3次，15 min/次，加封閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗（1∶2 000），4℃過夜，TBST洗膜3次，30 min/次，最后ECL顯色，經(jīng)曝光、顯影、定影后，觀察結(jié)果。通過Quantity One圖像分析軟件（Bio-Rad公司）讀取目的電泳條帶的斑點密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組的XPD、p52、以及p21的密度掃描值，獲得其蛋白相對表達(dá)量。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖力 上述3組細(xì)胞于對數(shù)期分別接種于96孔板中，每孔1×103個細(xì)胞，以培養(yǎng)基為對照組，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h后每孔加入5 g/L MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測定492 nm處各孔光密度（OD）值，取每孔平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，組間比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pEGFP-N2-XPD轉(zhuǎn)染結(jié)果 通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方式將pEGFP-N2和pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞40 h后，熒光顯微鏡下可見XPD組和N2組細(xì)胞中均有綠色熒光蛋白的表達(dá)，未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞則未見表達(dá)，見圖1。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)XPD、p52及p21 mRNAs表達(dá)量情況 XPD組中XPD mRNA、p21 mRNA表達(dá)量高于相應(yīng)N2組和空白對照組，而p52 mRNA表達(dá)量低于N2組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2、圖2。

表2 各組細(xì)胞XPD、p52、p21 mRNA的表達(dá)比較（±s）

表2 各組細(xì)胞XPD、p52、p21 mRNA的表達(dá)比較（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；表3同

組別XPD組（1）N2組（2）空白對照組（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）n666 XPD 0.984±0.005 0.339±0.004 0.298±0.010 9 288.947＊＊2.474＊1.723＊p52 0.213±0.007 0.617±0.007 0.596±0.066 104.335＊＊1.311＊1.766＊p21 0.862±0.005 0.197±0.012 0.205±0.011 4 605.148＊＊5.383＊＊5.893＊＊

2.3 各組細(xì)胞XPD、p52及p21蛋白的表達(dá)情況比較 XPD組中XPD、p21蛋白表達(dá)量高于N2組和空白對照組，而p52低于其他2組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表3、圖3。

表3 各組細(xì)胞XPD、p52、p21蛋白的表達(dá)情況（±s）

表3 各組細(xì)胞XPD、p52、p21蛋白的表達(dá)情況（±s）

組別XPD組（1）N2組（2）空白對照組（3）F q（1）∶（2）（1）∶（3）n666 XPD 0.913±0.014 0.284±0.021 0.267±0.023 174.683＊＊1.729＊1.479＊p52 0.211±0.009 0.589±0.007 0.607±0.008 236.551＊＊1.761＊1.320＊p21 0.892±0.009 0.273±0.009 0.255±0.011 418.692＊＊2.986＊2.506＊

2.4 pEGFP-N2-XPD重組質(zhì)粒對HepG2細(xì)胞增殖活力的影響 XPD組、N2組、空白對照組的OD值分別為0.475±0.010、0.927±0.016、0.934±0.010，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 213.506，P＜0.01）。XPD組與其他2組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

TFⅡH是一個多酶復(fù)合物，通過XPD的橋梁作用把核心亞復(fù)合物（由XPB、p62、p52、p44、p34及p8組成）和CAK亞復(fù)合物（由cdk7、cyclin H和MAT1組成）聯(lián)系起來。XPD作為TFⅡH的支架，在核苷酸切除修復(fù)過程中負(fù)責(zé)從5→3方向打開受損位置的DNA雙鏈。XPD基因發(fā)生突變時，核苷酸剪切修復(fù)受到影響，發(fā)生腫瘤的概率更高。最近研究發(fā)現(xiàn)，XPD及環(huán)境因素共同作用，與肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系[4]。

目前國內(nèi)外對XPD基因與p52基因間的關(guān)系研究報道尚少。p52又稱核因子（NF）-kappa B2，活化的NF-kappa B復(fù)合物是Rel多肽家族不同形式二聚體的組合，包括p50（NF-kappa B1）、p52（NF-kappa B2）、CRel、VRel、Rel（ALPG）和RelB。NF-kappa B信號傳導(dǎo)通路在不同腫瘤的演進(jìn)和發(fā)展過程中均起著關(guān)鍵的作用[5]。Ras具有誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的作用，而NF-kap?pa B可以抑制這一作用，從而促進(jìn)腫瘤生長[6]。在大部分肝癌中都有Bcl-3的異常表達(dá)，Bcl-3與NF-kappaB p50和p52相互作用，Bcl-3/p50或者Bcl-3/p52的相互作用對肝癌的發(fā)生有重要影響[7]。已有研究表明，XPD基因可激活p53[8]，而p53可以選擇性下調(diào)Bcl-3蛋白水平,抑制cyclin D1啟動子活性，降低cyclin D1蛋白和mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞在G1期阻滯，抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，將XPD轉(zhuǎn)染入HepG2肝癌細(xì)胞后，p52在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均有明顯下降，表明XPD對p52基因的表達(dá)可能有抑制作用，從而起到了抑制癌細(xì)胞生長的作用。

p21又稱細(xì)胞周期調(diào)控基因，可以通過2條途徑發(fā)揮作用，一是p53介導(dǎo)的途徑，p21WAFl/C1P1基因是p53基因最重要的下游特異性基因之一，當(dāng)細(xì)胞受到來自體外或體內(nèi)的各種損傷后，野生型p53蛋白作用于p21基因，使其迅速表達(dá)，從而發(fā)揮p21生物學(xué)功能。二是非p53依賴途徑，近年研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤壞死因子、組織型纖溶酶原激活劑等因素的作用下，p21基因可以脫離p53的作用快速發(fā)生反應(yīng)，使受損的細(xì)胞發(fā)生G1、G2期的細(xì)胞周期阻滯[9]。p21作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，p21蛋白表達(dá)減弱，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖失去有效監(jiān)控及瘤細(xì)胞惡性表型增加，從而參與腫瘤的形成和發(fā)展。本研究顯示轉(zhuǎn)染XPD后，p21的表達(dá)量上調(diào)，肝癌細(xì)胞生長受到抑制，進(jìn)一步證實了p21基因發(fā)揮的抑癌作用。

野生型p53是公認(rèn)的抑癌基因。研究表明，XPD基因可激活p53，并且影響其生物活性[8]，而p21是p53的下游激活產(chǎn)物，XPD可以通過p53間接上調(diào)p21。另一方面，p52又能抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21的表達(dá)[10]。所以筆者推測轉(zhuǎn)染后p52表達(dá)量的降低可能導(dǎo)致對p21抑制作用減弱，p21表達(dá)量增加。

綜上，XPD可與p21協(xié)同作用對肝癌細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制，XPD通過抑制促癌基因p52表達(dá)，降低HepG2肝癌細(xì)胞的增殖能力。所以，XPD基因的轉(zhuǎn)染可通過對相關(guān)基因的影響有效地抑制HepG2細(xì)胞的生長，可為臨床治療肝癌提供新的思路。

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