張曉娟,王廣策,何林文,陳昌生

(1.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071;2.中國科學院 研究生院,北京 100049;3.天津科技大學海洋學院,天津 100039;4.集美大學 漁業(yè)學院,福建 廈門361020)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC;EC 4.1.1.31)在二價金屬離子Mg2+或 Mn2+存在下,能夠催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與反應生成草酰乙酸(OAA)這一不可逆反應[1]：。該酶廣泛分布在高等植物、藻類、藍細菌、細菌、原生生物中,在動物和真菌中尚未發(fā)現(xiàn)[2-4]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在于所有的光合生物中,是光合作用中的關鍵酶,主要功能是為三羧酸循環(huán)補充四碳酸,在 C4植物和景天科植物光合代謝途徑中扮演著濃縮固定 CO2[4-5]。此外該酶還參與氨基酸代謝中碳骨架的回補、參與種子形成與萌發(fā)、果實成熟、植物保衛(wèi)細胞氣孔開閉、豆科植物根瘤固氮過程、維持離子和pH值平衡等諸多作用[6-10]。

在種族和系統(tǒng)演生進化過程的研究中,分子特征已經成為一種重要工具。近年來,PEP羧化酶的全氨基酸序列和全核苷酸序列甚至全序列的一部分能夠作為分子遺傳標記已為諸多研究者所報道[3,6,11-14],PEP羧化酶的序列特征能夠在生物體和代謝途徑之間建立系統(tǒng)發(fā)生關系。

壇紫菜是我國南方特有的深受亞洲人民歡迎的經濟紅藻,也是我國出口創(chuàng)匯的主要農產品之一。它屬于原紅藻綱(Protoflorideae)、紅毛菜目(Bangiales),是一種原始紅藻,具有特殊的生活史和世代交替現(xiàn)象,包含葉狀體(單倍配子體)和絲狀體(二倍孢子體),葉狀體在冬春季生長旺盛,主要分布于潮間帶礁石上。絲狀體渡夏,而且鉆入貝殼等碳酸鈣基質中生長,主要分布于潮下帶,是一種石內生藻類(endolithic algae)。壇紫菜pH值補償機制高,具有低的Km值,能利用作為光合作用時的碳源,其低的無機碳補償點表明壇紫菜具有濃縮碳的作用[15-16]。本實驗室的 Fan等[17]構建了壇紫菜絲狀體(孢子體)的11000條EST,同時在壇紫菜代謝途徑分析中,主要分析了無機碳的固定途徑,結果發(fā)現(xiàn)壇紫菜絲狀體階段可能存在類C4的固碳途徑。本實驗克隆了壇紫菜 PEP羧化酶基因的部分序列,對其做了系統(tǒng)進化分析,對進一步深入研究壇紫菜光合作用、碳代謝等具有重要的參考價值,同時為進一步研究其功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 壇紫菜絲狀體的獲得

試驗中所用的壇紫菜絲狀體為本實驗室(中國科學院海洋研究所藻類分子生理與發(fā)育調控實驗室)保留藻株,培養(yǎng)基為海水加富培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件為18℃,光強約為 1 800 lux,光：暗周期為 12 ：12,通入過濾法消毒后的空氣進行培養(yǎng),每周更換 1次培養(yǎng)基。用蒸餾水沖洗干凈后進行提取RNA。

1.2 試劑、試劑盒及儀器

總RNA提取采用天根生物公司的RNAprep pure試劑盒,cDNA合成采用Superscript ΙΙ? 反轉錄酶試劑盒(Invitrogen公司,USA)。 PCR擴增目的基因片段、DNA純化、連接所用試劑盒和載體為pMD-18T購自東盛生物公司和TaKaRa生物技術有限公司,菌株為E.coliTop 10。藥品均為進口分裝或國產分析純。序列測定委托上海生工生物技術公司完成。

1.3 壇紫菜PCPC同源序列的克隆

EST 的釣取及組裝：從 http：//est.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/上獲得了與條斑紫菜PEP羧化酶相關的 EST 序列：AU193218、AU193318、AU191558、AU188467、AV430322、AU195387、AU195597、AU192608、AU196318、AU191989、AU191907、AU195415、AU191278、AU192140、AU192294、AU196648、AU191070、AU190685、AV430724、AU192096、AU192037、AV431839、AU194305、AV433323、AU188200[18-19]。利用BioEdit生物學軟件對這些 EST序列進行拼接,從中設計 PEPCS1(5′-CTCCAGCATGTCGAATGTAGCG-3′)和 PEPCA1(5′-CCGTCGTGTACGTCTCAAGGGT-3′)一 對 引 物 ,以壇紫菜的cDNA為模板,進行PCR擴增,PCR儀器購自德國Eppendorf 公司。

PCR 反應條件為：94℃預變性 5min;94℃變性30s,60°C退火 30s,72℃延伸 2min,30個循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。

反應體系見表1。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的條帶用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化(購自北京天根生物公司)后克隆入 pMD18-T載體(TaKaRa),轉化到大腸桿菌 Top 10感受態(tài)細胞中,轉化后,于氨芐LB培養(yǎng)基上挑取單克隆培養(yǎng),用上述引物再次進行 PCR 擴增,以進一步驗證克隆為陽性,將陽性克隆送去上海生工生物技術公司采用ABI3730自動測序儀測序。

表1 PCR擴增體系Tab.1 PCR amplification system

1.4 RACE PCR克隆PEPC的3′末端

以接頭引物 AdapterdT(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC 1qzT17-3′)引導反轉錄合成。用通用引物up(5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′) 和 基 于PEPC部分序列設計的基因特異引物 E31(5′-GCCGCCCAAGACTATCAATG-3′)和 E32(5′-TCTACCGCTTCGTACACCCACT-3′),采用半巢式 PCR 的方法(semi-nested PCR)擴增基因3′末端。應用Touch down的PCR程序：25μL體系(同表1);94℃預變性5min;94℃變性 30s,66℃退火 30s(每一循環(huán)降低 0.6℃),72℃延伸1min,10個循環(huán);94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,25個循環(huán);72°C延伸10min;4°C保存。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的條帶用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化(購自北京天根生物公司)后克隆入 pMD18-T載體(TaKaRa,大連寶生物公司),轉化到大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞中,轉化后,于氨芐 LB培養(yǎng)基上挑取單克隆培養(yǎng), 用上述引物再次進行 PCR 擴增,以進一步驗證克隆為陽性,將陽性克隆送去測序。

1.5 序列分析

序列同源性對比采用 NCBI中的 BLAST軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行;氨基酸序列分析采用 ExPASy在線工具(http：//www.expasy.org/);結構域預測采用Pfam HMM軟件(http：//pfam.sanger.ac.uk/search);信號肽預測采用 SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/);TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)用于尋找跨膜結構;根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫對壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列進行活性位點的分析。重建系統(tǒng)進化樹所用的PEP羧化酶核苷酸序列通過對GenBank的BLAST檢索獲得。重建PEP羧化酶的系統(tǒng)進化樹時,選取了16個有代表性的序列(來自不同類群,如表2所示)。

2 結果與討論

2.1 序列分析

所克隆的序列長為 2 538 bp,與原從條斑紫菜EST數(shù)據(jù)庫中拼接出的 PEPC序列片段相似性高達89.5%。該片段是一個連續(xù)的讀碼框,在閱讀框中不存在起始密碼子,但還有一個 TAG終止密碼子,191bp的 3′端非編碼區(qū)(UTR)和 ploy A 尾巴,編碼846個氨基酸。3′端非編碼區(qū)(UTR)沒有找到傳統(tǒng)的AAUAAA的加尾信號,這在其他紅藻中也很少有發(fā)現(xiàn),如Porphyra yezoensis的β-tubulin基因和carbonic anhydrase基因[20-21],以及Gracilaria gracilis的galactose1-phosphate uridyl transferase 基因[22]。

BLASTx檢索發(fā)現(xiàn)所有的同源序列均為磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC),且同源性很高。以Blast軟件對壇紫菜PEPC基因氨基酸序列的相似性比對結果表明,PEPC 與被子植物,裸子植物,藻類和細菌均有一定的一致性,如與玉米(Zea mays)為 46%,與蘆薈(Aloe arborescens)為 46%,與水稻(Oryza sativa Japonica Group)為47%,與大腸桿菌的(Escherichia coli)為 35%,一致性范圍在 35%～50%之間,由于 C4型的 PEPC的 C末端第774位或附近的一個氨基酸均為絲氨酸(S),而所有C3或CAM型的PEPC相應位置均為丙氨酸(A)[1,4,23-24],本研究中的PEPC在相對應位置為丙氨酸(A),所以不可能是一個C4型的PEPC(圖1)。

表2 構建系統(tǒng)進化樹所用序列Tab.2 PEPC isoforms used for phylogenetic analysis

圖1 部分C3,C4植物PEPC氨基酸部分序列的比較Fig.1 Partial sequence alignment of amino acid residues of PEPC from some C3 and C4 plants

Pfam HMM 軟件分析顯示氨基酸序列中的第130至第841個氨基酸之間為PEP羧化酶的結構域;信號肽預測SignalP和TMHMM在線軟件分析顯示該段序列既沒有信號肽序列,也沒有跨膜結構。

圖2 壇紫菜PEPC核苷酸及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of PEPC from Porphyra haitanensis

根據(jù)PROSITE數(shù)據(jù)庫分析,其氨基酸序列含有兩個大的 PEP羧化酶活性位點,分別為 PS00781(VLTAHPTQAVRR)和PS00393(VMVGYSDSGKDGG),另外還含有4種模式的其他功能位點,分別為：依賴于 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site,PS00004),蛋白激酶 C磷酸化位點(Protein kinase C phosphorylation site,PS00005),酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(Casein kinase II phosphorylation site,PS00006)和 N-端十四烷?；稽c(N-myristoylation site,PS00008)。

2.2 系統(tǒng)進化分析

多序列比對采用 Clustal X 程序,采用 Clustal X 程序和MEGA 4.0 軟件,以臨位相聯(lián)法(Neighbor-Joining)法來重建,計算方法重復1 000次,進化距離選擇 p距離(p-distance),空缺或者缺失(gaps/missing data)的處理采用完全刪除(complete deletion),以此構建的系統(tǒng)進化樹如圖3所示。

圖3 采用N-J 法以Clustal X和MRGA4.0軟件構建的系統(tǒng)進化樹(計算重復1000次)Fig.3 Phylogenetic analysis of 17 PEPC isoforms.In this Neighbor-joining consensus tree,numbers on internal branches are percent bootstrap values of 1000 replicates

對 PEP羧化酶進行進化分析,同時選取了裸子植物、被子植物、藻類及微生物中的16個序列,結果如圖2所示。壇紫菜PEPC羧化酶氨基酸序列以及綠藻中的萊因衣藻(C.reinhardtii)和綠藻(Micromonassp.),都不和其他的聚類。種子植物和裸子植物中的C3型的PEPC及CAM型的PEPC聚為一個大的進化支,雖然種子植物和裸子植物中的 C4型的PEPC各聚為一支,但他們的進化距離相當。大腸桿菌與硅藻(Phaeodactylum tricornutum和Thalassiosira pseudonana)聚為同一支,是與他們之間的進化關系密切相連的,硅藻中有數(shù)百個基因是來自于細菌的[25],所以他們都可以歸為細菌型的 PEP羧化酶。本系統(tǒng)進化圖與 Gehrig等[13-14]1998年和 2001年構建的PEP羧化酶部分氨基酸序列基本上是一致的。

如前人所述, PEP羧化酶可以分為四種類型：C3型、C4型,CAM型及細菌型,C3亞型最先出現(xiàn),C4和CAM亞型被認為是由C3亞型進化而來,而且二者分別多次獨立起源[1,6,26],本實驗構建的系統(tǒng)進化樹圖很好的詮釋了PEPC的代謝途徑與進化關系。

在本圖中,從大的分支上來說,壇紫菜 PEP羧化酶氨基酸序列是與綠色植物聚在一支的,是完全有別于細菌類型的 PEP羧化酶的一支,從進化上來看,壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列更接近于C3型(這在之前的序列分析中也有所體現(xiàn)),進化上更為古老。紅藻最初依據(jù)林曼系統(tǒng)分類法歸為植物,但后來歸為最古老的真核生物,關于紅藻的進化和起源一直是困擾科學家的一個問題。本進化圖中壇紫菜PEP羧化酶氨基酸序列的進化可能也與紅藻特殊的進化地位有關系。

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